Đếm số lượng tế bào vi sinh vật có một ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá chất lượng vi sinh các chế phẩm sinh học, lương thực, thực phẩm (thức ăn, nước uống…), đồng thời đánh giá điều kiện môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu sinh khối…
Việc đếm số lượng tế bào vi sinh vật thường được thực hiện theo 2 phương pháp chủ yếu là đếm trực tiếp và đếm gián tiếp.
Mục đích
- Trang bị cho sinh viên kỹ năng thực hành đếm số lượng tế bào vi sinh vật trong dung dịch hoặc môi trường nuôi cấy.
- Yêu cầu sinh viên phải hiểu được ý nghĩa và nguyên tắc của việc đếm số lượng tế bào vi sinh vật
- Sinh viên phải nắm vững qui trình, cách thức tiến hành và thao tác đếm số lượng tế bào vi sinh vật từ các loại mẫu khác nhau.
1. Nguyên vật liệu và thiết bị
Thiết bị và dụng cụ
- 1 kính hiển vi vật kính x10, x40, lamelle - 1 kim cấy và 1 đèn cồn
- 1 Buồng đếm hồng cầu Thomas hoặc Neubaur
- 2 micropipette và 4 đầu col 1ml vô trùng, 4 đầu col 0, 1-0,2ml - 2 vial đã khử trùng
- 6 ống nghiệm 10ml dùng để pha loãng dịch mẫu vi khuẩn - 7 đĩa petri đã khử trùng.
- Bút lơng dầu
Vật liệu và hóa chất
- Mẫu vi sinh vật (mẫu vi sinh vật cấy trên môi trường đặc, mẫu sữa, mẫu nước…)
- Dịch nấm men hoặc ống giống nấm men nuôi cấy 48 giờ - Mẫu cám, bắp, thịt…
- Môi trường dinh dưỡng (TSA, NA, PCA…) 1 đĩa/1 sinh viên - 1 chai chứa 1lít nướcmuối sinh lý hoặc cất đã khử trùng
127
- Mẫu phải được pha loãng. Tuỳ theo mức độ nhiễm khuẩn của mẫu ta có sự ước lượng pha lỗng 1/5; 1/10 ; 1/20 hay 1/10; 1/100; 1/1000……..
- Dung dịch dùng pha loãng mẫu thường là NaCl 9%0 hay phot phat đệm đã được vô trùng.
- Cách pha:
+ Mẫu 1/5 : 1ml mẫu + 4ml NaCl 9%0 + Mẫu 1/10: 1ml mẫu + 9ml NaCl 9%0
- Từ mẫu 1/10 (10-1) lấy 1ml + 9ml NaCl 9%0 ta có độ pha lỗng 10-2 , cứ như vậy ta có các độ pha loãng tiếp theo 10-3, 10-4……..
3. Phương pháp đếm
3.1. Đếm trực tiếp trong buồng đếm
a. Cấu tạo buồng đếm
Hình 2: Buồng đếm tế bào vi sinh vật 1/100
1/102 1/103 1/104
1ml 1ml 1ml
128
- Buồng đếm là một phiến kính trong, dày, hình chữ nhật.
- Giữa là phần lõm phẳng, có kẻ một hoặc hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ. Bên ngồi có ghi tên loại buồng đếm, và ghi các thơng số kỹ thuật như hình trên. b. Cấu tạo khung đếm
Cấu tạo một khung đếm có:
- Trường hợp 1: 1 khung có 16 ơ lớn, 1 ơ lớn có 25 ơ nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ơ nhỏ.
- Trường hợp 2: 1 khung có 25 ơ lớn, 1 ơ lớn có 16 ơ nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ơ nhỏ.
- Diện tích 1 ơ nhỏ là 1/400 mm2 . Vậy Vô nhỏ = 0.1 mm x 1/400 mm2 = 1/4000mm3.
c. Cách tiến hành
- Đặt lammen sạch phủ lên khung đếm.
- Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch nấm men đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu, bơm nhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm và lammen.
- Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lammen, hơi thừa một ít. Nếu bị bọt kẹt lại trong lammen thì phải làm lại.
- Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm. - Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó dùng vật kính x40 để đếm.
- Đếm số tế bào trong 5 ô lớn ( 4 ô ở cạnh, 1 ô ở giữa), đếm lần lượt từng ô nhỏ trong 1 ô lớn. Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ơ trước, sau đó đếm số tế bào nằm ở cạnh phía trên và cạnh bên phải ô.
129
- Hoặc đếm 125 ô nhỏ có trong 5 ơ lớn (T/h: 1 ơ lớn có 25 ơ nhỏ). d. Cơng thức tính.
Số tế bào/1 ml mẫu = a x 4.000 x 1.000 /H
Trong đó: a = số tế bào trung bình có trong 1 ơ nhỏ (V = 1/ 4.000 mm3 ) 4.000 = số qui đổi từ 1/4.000 mm3 thành 1 mm3 .
1.000 = số qui đổi từ 1 mm3 thành 1ml (1ml = 1.000 mm3 ) H = hệ số pha lỗng (ví dụ: H = 10-2)
e. Chú ý:
- Chỉ đếm được tổng số tế bào, không thể biết tế bào nào còn sống, tế bào nào đã chết.
- Nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10 tế bào.
- Sử dụng xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô.
- Để đạt độ chính xác cao, thì số tế bào trung bình đếm được trong 1 ơ nhỏ: 2.5 < a <10.
3.2. Phương pháp đếm gián tiếp trên môi trường thạch đĩa
Đếm gián tiếp người ta khơng nhìn thấy và khơng đếm trực tiếp từng tế bào vi sinh vật. Số lượng vi sinh vật trong mẫu được xác định một cách gián tiếp thông qua sự sinh trưởng và phát triển của chúng trên môi trường dùng để nuôi cấy chúng. - Nguyên tắc: phương pháp đếm gián tiếp số lượng tế bào vsv trên môi trường thạch đĩa dựa trên việc đếm số lượng khuẩn lạc vsv mọc trên môi trường sau thời gian nuôi cấy vsv cần đếm ở 37oC/24 giờ.
a. Nguyên tắc
Nguyên tắc căn bản trong phương pháp này là mỗi một khuẩn lạc được tính
như là một tế bào vsv có trong mẫu ban đầu.
Cấy một thể tích xác định dịch mẫu đã pha lỗng lên đĩa petri mơi trường thích hợp.
Đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời gian ni cấy vì mỗi khuẩn là kết quả phát triển của một tế bào.
130
Dùng bút lông kim ghi lên đáy hộp môi trường: tên mẫu, tên người thực hiện, ngày cấy, thể tích dịch cấy, nồng độ pha loãng.
Cách 1: Dùng pipette vơ khuẩn hút dịch pha lỗng cho vào 3 đĩa petri môi trường, thể tích bằng nhau, mỗi đĩa có V từ 0,1 ml – 0,5 ml. Lấy que gạt dàn đều mẫu lên mặt thạch để tách riêng từng tế bào.
Cách 2: Dùng pipette vô khuẩn hút Vml dịch pha lỗng cho vào 3 đĩa petri vơ khuẩn, thể tích bằng nhau, mỗi đĩa có V từ 0,1 ml – 0,5 ml.
Mơi trường pha sẵn trong bình 250ml, bảo quản lạnh. Đun cách thủy mơi trường cho tan đều, chờ nguội 40ºC, đổ vào các đĩa chứa mẫu, mỗi đĩa 10 - 15 ml môi trường. Xoay tròn đĩa theo chiều kim đồng hồ và ngược lại cho mơi trường hịa đều mẫu, để n cho mơi trường đặc hồn tồn.
Ở 2 cách trên, mỗi mẫu đều cấy 3 nồng độ liên tiếp. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa petri, sau đó lấy kết quả trung bình. Đặt tất cả các đĩa đã cấy vào tủ ấm, ni ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
c. Cách đếm khuẩn lạc
Dùng bút lông kim và thước, kẻ các ô vuông ở đáy hộp, cạnh ô vuông từ 10 – 15 mm. Đếm số khuẩn lạc trong các ơ vng theo lần lượt theo hình zic zắc.
131
d. Cơng thức tính
N: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn) vi khuẩn trong 1 g hay 1ml mẫu. C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn.
n1 : Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ 1. di: Hệ số pha loãng thứ i.
v: thể tích dịch mẫu(ml) cấy vào mỗi đĩa petri.
4. Thực hành: Sinh viên thực hiện
- Định lượng trực tiếp số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis trên lame
- Định lượng trực tiếp số lượng tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu. - Định lượng gián tiếp vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa.
5. Báo cáo kết quả
132
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Huỳnh Ngọc Thanh Tâm (2019), Giáo trình phương pháp phân tích vi sinh vật, NXB ĐH Cần Thơ.
2. Nguyễn Ngọc Hải (2017), Giáo trình Vi sinh vật đại cương, NXB Đại học Quốc gia Tp HCM.
3. Nguyễn Ngọc Hải (2012), Giáo trình Thực hành Nghiên cứu Vi sinh vật, NXB Lao Động.
4. Phạm Hồng Sơn, Nguyễn Văn Hoà, (2017), Bài giảng vi sinh vật đại cương,