4. Kỹ thuật giải trình tự DNA tự động dựa trên phương pháp giải trình tự Sanger kinh điển.
4.2.1. Chuẩn bị DNA cần giải trình tự
* DNA khuôn
DNA khuôn để giải trình tự rất đa dạng, có thể là bộ gen của tế bào (genomic DNA), , cDNA, thư viện DNA, RNA, plasmid, phage, cosmid,.... Bên cạnh đó cũng có các sản phẩm khuôn thương mại như: genomic DNA, các thư viện DNA. Các chế phẩm này có nguồn gốc từ động vật, các loại thực vật hoặc các dòng tế bào khác nhau.
DNA có thể được giải trình tự trực tiếp sau tách chiết hoặc sau khi dòng hóa vào vi khuẩn hoặc sau khi đã được khuếch đại bằng phản ứng PCR. Vì PCR là phản ứng chuỗi cực nhạy, có thể chỉ cần dùng một phân tử DNA làm khuôn cũng thu được sản phẩm nhưng đây cũng là nguyên nhân chắnh gây ra sự dương tắnh giả do các DNA ngoại nhiễm. Do vậy, đoạn DNA khuôn (DNA template, DNA target) tinh sạch là một yếu tố quan trọng giúp cho phản ứng PCR tạo ra các sản phẩm chắnh xác. Lượng khuôn cho mỗi phản ứng cần được thăm dò trước tùy thuộc vào nguồn gốc của khuôn. Trong một số trường hợp đặc biệt,
chúng ta có thể tăng số lượng khuôn để có thể giảm số lượng chu kỳ của phản ứng PCR vắ như trong tái tổ hợp gen. Thông thường kắch thước đoạn DNA khuôn nhỏ hơn 3 kb cho kết quả nhân gen tốt nhất.
Mạch DNA khuôn mẫu cũng có thể ảnh hưởng đến phản ứng chuỗi. Nếu DNA này chứa nhiều GC thì sẽ khó khăn trong việc tách rời các chuỗi DNA ở nhiệt độ cao. Trong trường hợp này việc bổ sung formide hay dimethy sulfoxide (DMSO) vào hỗn hợp phản ứng có thể khắc phục được hiện tượng này.
* Thiết kế các đoạn olygonucleotid mồi khuếch đại DNA khuôn
Mồi là những đoạn olygonucleotid có chiều dài khoảng 20-30 nucleotid. Các đoạn mồi là thành phần quyết định sự khuyếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao của phản ứng PCR. Để thực hiện nhân một đoạn DNA bằng phản ứng PCR, cần phải lựa chọn cặp mồi thắch hợp, bắt cặp đặc hiệu với DNA khuôn. Mỗi cặp mồi gồm một mồi xuôi và một mồi ngược. Mồi xuôi có trình tự acid nucleic tương đồng với trình tự của mạch DNA không mang mã (mạch antisense), mồi xuôi bắt cặp ở đầu 3Ỗ của mạch không mang mã (mạch 5, - 3Ỗ). Mồi ngược có trình tự tương đồng với trình tự của mạch DNA mang mã di truyền (mạch sense), mồi ngược bắt cặp với mạch sense ở đầu 3, (mạch 3Ỗ- 5,). Nồng độ mồi khoảng 0.1- 1μM. Nồng độ thường được xác định dựa vào giá trị OD (optical density) đo ở bước sóng 260 nm.
Mồi được chào bán ở rất nhiều công ty thương mại. Tuy nhiên trên thực tế các nhà nghiên cứu có thể tự thiết kế mồi dựa trên một số nguyên tắc như sau:
- Có chiều dài khoảng 20-30 nucleotid, đặc hiệu với đoạn gen đắch - Có số lượng tương đương các nucleotid
- Tránh lặp lại trình tự các nucleotid hoặc những đoạn chứa các nucleotid giống nhau
- Không nên có ≥ 3G hoặc C ở đầu 5, (dễ dẫn đến bắt cặp nhầm ở những vùng DNA khuôn giàu GC)
- Tránh sự hình thành các cấu trúc bậc 2 của mồi do các vùng của mồi có khả năng liên kết bổ sung với nhau.
- Trình tự nucleotid ở đầu 3, không được liên kết bổ sung với nhau hoặc với các mồi khác để hình thành phức hợp 2 mồi.
* Kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA bằng quang phổ kế + Phương pháp đo quang phổ kế cho phép xác định một cách tương đối nồng độ DNA có trong mẫu nghiên cứu, đồng thời kiểm tra được độ tinh sạch của mẫu đã tách chiết.
+ Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các bazơ purin và primidin. Từ giá trị mật độ quang học (OD - Optical Density) ở bước sóng 260 nm của mẫu đo cho phép xác định nồng độ axit nucleic trong mẫu.
+ Một đơn vị OD tương ứng với nồng độ là: 50 ộg/ml cho dung dịch DNAsợi đôi.
40 ộg/ml cho dung dịch RNAhay DNA sợi đơn. + Nồng độ DNA hay RNA được tắnh theo công thức sau:
-Công thức tắnh nồng độ DNA sợi đôi (CADN): CDNA = OD260 x 50 x d
d : độ pha loãng mẫu
- Công thức tắnh nồng độ RNA hay DNA sợi đơn (CDNA/RNA): CDNA/RNA = OD260 x 40 x d
Cách tắnh trên chỉ chắnh xác khi dung dịch axit nucleic sau tách chiết được tinh sạch vì giá trị thật của nồng độ axit nucleic có thể bị sai lệch bởi các protein (cấu trúc từ acid amin thơm hoặc dị vòng) trong sản phẩm tách chiết không tinh sạch cũng có khả năng hấp thụ ở bước sóng 260 nm. Tuy nhiên, các protein này lại hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm, do đó ta đo thêm ở bước sóng 280 nm để kiểm tra độ sạch của dung dịch.
Để đánh giá mức độ sạch của dung dịch tách, người ta tắnh tỉ số OD260/OD280 = T.
Nếu 1,8 < T < 2,0 thì dung dịch axit nucleic đó được coi là tinh sạch. + Cách tiến hành đo mật độ quang của DNA trong sản phẩm tách chiết bằng máy NanoDrop:
Ớ Nhỏ 1ộl nước cất tinh khiết vô trùng (đã sử dụng trong quá trình pha loãng DNA khi tách chiết) vào buồng đọc để xác định kết quả ống trắng.
Ớ Trộn đều nhẹ nhàng sản phẩm tách chiết, ly tâm nhẹ. Nhỏ 1ộl sản phẩm vào buồng đọc.
Ớ Máy tự động đánh giá nồng độ DNA và độ tinh sạch của sản phẩm trên đồ thị.