Các phương pháp PCR thông thường chỉ đánh giá định tính mà không đánh giá định lượng vi rút. Real-time PCR là phương pháp khuếch đại đích có độ nhạy cao, thường được sử dụng trong định tính và định lượng DNA HPV.
Real-time PCR cho phép khuếch đại và xác định số lượng bản sao được tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt. Kết quả DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên sự tỷ lệ thuận giữa tín hiệu huỳnh quang phát ra và số lượng bản dao DNA được tổng hợp.
Đường chuẩn của phản ứng được xây dựng dựa trên số lượng bản sao DNA đích trong một gam mẫu chuẩn và xác định giá trị chu kỳ ngưỡng cho từng mẫu tương ứng. Chu kỳ ngưỡng (Ct-threshold cycle) là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời điểm đó sản phẩm PCR cho tín hiệu huỳnh quang tăng vọt vượt qua cường độ huỳnh quang nền. Nếu số lượng DNA đích càng lớn thì Ct càng nhỏ
và nếu số lượng DNA đích ít thì cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn. Phản ứng real- time PCR lý tưởng khi tín hiệu huỳnh quang tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt.
Chất phát huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA làm bản sao DNA đích được tạo ra phát huỳnh quang khi có nguồn sáng kích thích. Chất phát quang thường được sử dụng là SYBR Green 1 hoặc các mẫu dò đặc hiệu (Taqman probe, Beacon probe, Hybridization probe...).
Phương pháp real-time PCR có thể thực hiện nhanh, giá thành không đắt, định lượng được sản phẩm DNA và RNA. Phương pháp này có thể phát hiện được 10.000 chuỗi gen sao chép/phản ứng (khoảng 100 tế bào bị nhiễm). Việc xác định số lượng vi rút cho phép xác định được mRNA, đánh giá sự hoạt động của gen E6 và E7. Khi 2 vùng gen này hoạt động sẽ gây ra những biến đổi cũng như cho các sản phẩm của các vùng gen này. Đây là phương pháp có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 70%.
Trên thương mại có các loại Kít khác nhau dựa trên nguyên lý của real-time PCR như Roche LightCycler 2, Applied Biosystems 7900 HT và Corbett Rotor-Gene 6600. Những Kít này thường được sử dụng trong chẩn đoán in vitro tại Châu Âu, tuy nhiên vẫn chưa được FDA công nhận.