CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3Các bƣớc tiến hành nghiên cứu
- Các mẹ có HBsAg (+), khơng có biểu hiện bệnh gan đƣợc lấy máu tĩnh mạch ngay sau sinh.
- Con của các mẹ nói trên đƣợc lấy máu cuống rốn ngay sau sinh. - Các trẻ trên đƣợc lấy máu tĩnh mạch sau 12 tháng.
- Các mẫu máu nghiên cứu đƣợc xác định các dấu ấn: HBeAg, Anti – HBe, Anti – HBc bằng kỹ thuật ELISA.
- Tách DNA từ huyết thanh của các mẫu máu đƣợc chọn.
- Đánh giá độ tinh khiết của DNA sau tách bằng đo mật độ quang (OD) bƣớc sóng 260/280nm trên máy quang phổ tử ngoại.
- Thực hiện kỹ thuật PCR để xác định sự có mặt của gen Core/PreCore bằng bộ sinh phẩm QIAamp DNA của hãng QIAGEN – Đức.
- Toàn bộ các bƣớc kỹ thuật đƣợc tiến hành trong buồng vơ trùng và có mẫu kiểm chứng.
2.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.4.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện các dấu ấn HBeAg, anti – HBe, anti – HBc có trong huyết thanh.
2.4.1.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện HBeAg trong huyết thanh: Bằng bộ sinh phẩm MONOLISA HBe của hãng BIO – RAD.
Pha các dung dịch cần sử dụng:
- Dung dịch rửa: dung dịch rửa R2 đƣợc pha loãng 10 lần với nƣớc cất. - Dung dịch cộng hợp: pha loãng dung dịch R7b với dung dịch R2 đã đƣợc pha ở trên theo tỷ lệ 1/5.
- Cơ chất OPD: hòa một viên OPD (R9) vào 10 mL dung dịch đệm cơ chất R8 (peroxidase), lắc đều. Dung dịch này chỉ nên pha trƣớc khi dùng 5 – 10 phút, cần tránh ánh sáng trực tiếp khi pha và bảo quản nơi tối.
Các bước tiến hành:
- Cho 100 µL cho mỗi mẫu chứng dƣơng, chứng âm, mẫu huyết thanh cần thử vào các giếng. Đậy kín các giếng ủ ở nhiệt độ phòng qua đêm. - Rửa 4 lần bằng dung dịch rửa rồi hút khô.
- Nhỏ 100 µL dung dịch cộng hợp cho mỗi giếng, đậy kín các giếng rồi ủ ở nhiệt độ 400
C trong 30 phút.
- Dùng dung dịch rửa, rửa sạch các giếng nhiều lần. - Hút sạch bằng máy hút chân khơng.
- Thêm 100 µL cơ chất OPD cho mỗi giếng, ủ ở 180C – 200C trong tối 30 phút.
- Nhỏ 50 µL dung dịch dừng phản ứng (H2SO4 4M).
- Đọc kết quả sau 5 phút bằng mắt thƣờng hoặc máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 450 – 620nm.
2.4.1.2 Kỹ thuật ELISA phát hiện anti – HBe trong huyết thanh: Bằng bộ sinh phẩm số 1561 của hang PHAMATECH
Các bước tiến hành:
- Lấy số giếng cần dùng, ghi sơ đồ nhỏ mẫu.
- Nhỏ 1 giọt các chứng, nhỏ 50 µL huyết thanh cần thử vào mỗi giếng. - Nhỏ vào mỗi giếng 1 giọt dung dịch enzyme cộng hợp, rồi 1 giọt dung dịch trung hòa phản ứng vào mỗi giếng.
- Lắc nhẹ, đậy kín các giếng. Ủ 370C trong 60 phút. - Hút rửa các giếng 10 lần bằng dung dịch rửa. - Đập trên giấy thấm để làm sạch nƣớc còn đọng.
- Nhỏ 1 giọt chất nền A và 1 giọt chất nền B vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
- Nhỏ 1 giọt dung dịch dừng phản ứng.
- Đọc kết quả bằng mắt thƣờng hoặc quang phổ kế ở bƣớc sóng 450nm 2.4.1.3 Kỹ thuật ELISA phát hiện anti – HBc trong huyết thanh: Bằng bộ sinh phẩm MONOLISA anti – HBc PLUS của hãng BIO – RAD.
Pha các dung dịch cần sử dụng:
- Dung dịch rửa: dung dịch rửa R2 đƣợc pha loãng 10 lần với nƣớc cất. - Cơ chất TMB: dung dịch cơ chất TMB (R9) pha với dung dịch đệm cơ chất R8 theo tỷ lệ 1:11 rồi lắc đều. Dung dịch này chỉ nên pha trƣớc khi dùng 5 – 10 phút, cần tránh ánh sáng trực tiếp khi pha và bảo quản nơi tối. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các bước tiến hành:
- Cho 200 µL dung dịch pha lỗng mẫu vào mỗi giếng.
- Cho 20 µL cho mỗi mẫu chứng dƣơng, chứng âm, mẫu huyết thanh cần thử vào các giếng. Đậy kín các giếng ủ ở 370C trong 30 phút.
- Rửa 4 lần bằng dung dịch rửa rồi hút khô.
- Nhỏ 200 µL dung dịch cộng hợp cho mỗi giếng, đậy kín các giếng rồi ủ ở nhiệt độ 370
- Hút sạch bằng máy hút chân không.
- Thêm 100 µL dung dịch cơ chất TMB cho mỗi giếng, ủ ở 180C – 200C trong tối 30 phút.
- Nhỏ 100 µL dung dịch dừng phản ứng (H2SO4 1M).
- Đọc kết quả sau 5 phút bằng mắt thƣờng hoặc máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 450 – 620nm.
2.4.2 Kỹ thuật PCR xác định gen Core/Pre – Core
Khuếch đại DNA – HBV trong ống nghiệm bằng PCR. DNA – HBV đƣợc phát hiện bằng PCR với hai cặp mồi. Một cặp mồi khuếch đại vùng gen Core, và một cặp khuếch đại vùng gen PreCore.
Quy trình bao gồm hai giai đoạn chính: giai đoạn 1 tách chiết DNA – HBV từ huyết thanh ngƣời, và giai đoạn 2 thực hiện kỹ thuật PCR.
Các mẫu huyết thanh đƣợc tách DNA bằng bộ sinh phẩm QIAamp DNA của hãng QIAGEN – Đức. Toàn bộ kỹ thuật đƣợc tiến hành trong buồng vơ trùng và có mẫu kiểm chứng.
Quy trình kỹ thuật tách DNA từ huyết thanh:
- Cho 20 µL dung dịch proteinase K vào ống 1,5 ml vô trùng.
- Thêm 150 µL dung dịch PBS và 50 µL huyết thanh cần tách DNA vào ống, trộn đều.
- Thêm 200 µL dung dịch đệm ly giải (AL), trộn kỹ (15 giây), ly tâm nhanh (5 giây), ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút.
- Ly tâm nhanh rồi cho thêm 200 µL ethanol và trộn đều.
- Chuyển toàn bộ hỗn dịch trên vào cột ly tâm QIAamp rồi ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút.
- Thêm vào cột 500 µL dung dịch rửa AW1, rồi ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút.
- Cho tiếp vào cột 500 µL dung dịch rửa AW2, rồi ly tâm tốc độ 14000 vòng/phút trong 3 phút.
- Thêm 55 µL nƣớc cất vơ trùng, rồi ủ ở nhiệt độ phịng trong 1 phút sau đó ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút.
- Phần dịch thu đƣợc sau ly tâm là DNA đã đƣợc tách chiết sẽ tiếp tục sử dụng ở phản ứng PCR.
Đánh giá độ tinh khiết của DNA sau tách: bằng đo mật độ quang (OD)
bƣớc sóng 260/280nm trên máy quang phổ tử ngoại.
Khuếch đại DNA HBV bằng PCR:
Tiến hành kỹ thuật PCR với cặp mồi xác định vùng gen Core.
- Dung dịch phản ứng gồm có:
+ Master Mix: 12,5 µL/1 mẫu thử. + DNA đích: 1 µL/1 mẫu thử.
+ Mồi xi (mồi CG1F): 1 µL/1 mẫu thử. + Mồi ngƣợc (mồi CG1R): 1 µL/1 mẫu thử. + Nƣớc cất vừa đủ: 25 µL/1 mẫu thử. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cặp mồi trong phản ứng có trình tự:
F: 5’ – TGT GGA GTT ACT CTC TTT TTT GCC – 3’ Vị trí từ 1938 – 1961. R: 5’ – CGG AGG TGT TGA TAA GAT AGG GG – 3’ Vị trí từ 2313 – 2334.
- Sản phẩm khuếch đại có độ dài 396 cặp bazơ.
Tiến hành kỹ thuật PCR với cặp mồi xác định vùng gen PreCore.
- Dung dịch phản ứng gồm có:
+ Master Mix: 12,5 µL/1 mẫu thử. + DNA đích: 1 µL/1 mẫu thử.
+ Mồi xi (mồi F): 1 µL/1 mẫu thử. + Mồi ngƣợc (mồi R): 1 µL/1 mẫu thử. + Nƣớc cất vừa đủ: 25 µL/1 mẫu thử.
F: 5’ – GAG ACC ACC GTG AAC GCC CA – 3’ Vị trí từ 1611 – 1630. R: 5’ – CCT GAG TGC TGT ATG GTG AGG – 3’ Vị trí từ 2048 – 2072.
- Sản phẩm khuếch đại có độ dài 461 cặp bazơ. - Chu trình nhiệt của PCR:
+ 950C, 10 phút làm nóng phản ứng.
950C, 1 phút làm biến tính tách đơi sợi DNA.
550C, 30 giây để gắn mồi vào DNA mẫu. (35 chu kỳ) 720C, 1 phút nối dài sợi DNA đến hết khn.
+ 720C, 7 phút là thời gian hồn tất kết thúc phản ứng. + 40C lƣu giữ sản phẩm.
- Thời gian hoàn tất phản ứng khoảng 2 giờ 45 phút.
- Kiểm tra sản phẩm thu đƣợc bằng điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm TAE. Để phát hiện DNA, ta dùng Ethilium Bromide, là một chất màu bám vào DNA và thấy đƣợc dƣới đèn cực tím.