Bảng 3.6: Số copy trong từng dung dịch WSSV
Tên mẫu Số copy /ml
WSSV No1- nhân lên từ tôm sú (ĐH Cần Thơ) 2,15 x 107
WSSV No2 (Viện RIA2-TPHCM) 1,71 x 106
WSSV No3 – nhân lên từ tôm thẻ chân trắng (Viện RIA1) 2,08 x 107
WSSV No4 (PTNTĐCNEP) 7,73 x 108
3.3.3.2. Xác định liều gây chết tôm 75% (LD75) của dịch WSSV
Kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm cảm nhiễm tơm thẻ chân trắ ng bằng WSSV (Hình 3.24) cho thấy bắt đầu xuất hiện tôm chết ở lô nồng độ WSSV 2,6x105 copy/ml, từ 2 - 4 ngày sau khi cảm nhiễm bằng virus. Đến ngày thứ 5, trên 75% tơm ở lơ có nồng độ WSSV 2,6x105, 2,6x104 copy/ml đã bị chết và đến ngày thứ 6 và thứ 7 thì 100% tôm ở các lô có nồng độ WSSV tƣơng ƣ́ng 2,6x105 và 2,6x104 copy/ml đã bị chết . Cịn ở lơ có nồng độ WSSV2,6x102
copy/ml và 2,6x103 copy/ml tỷ lệ tôm chết ở ngày thứ 7 đạt mƣ́c 46,7% và 56,7%. Trong khi đó tỷ lệ tơm chết tự nhiên ở lô đối chứng âm (không bi ̣ cảm nhiễm WWSSV ) là 6,3%. Các dấu hiệu bệnh lý của tơm thí nghiệm quan sát đƣơ ̣c cũng tƣơng tự nhƣ tơm nhiễm WSSV ngồi tự nhiên. Tơm thử nghiệm thƣờng có dấu hiệu bỏ ăn (thức ăn dƣ thừa nhiều), lƣời vận động, đỏ thân và một số xuất hiện đốm trắng ở dƣới mang. Ngoài ra một số tơm chết nhƣng khơng có dấu hiệu bệnh lý, tuy nhiên chúng tôi vẫn thu đƣợc kết quả dƣơng tính khi tiến hành kiểm tra sự hiện diện của WSSV bằng phƣơng pháp PCR.
Hình 3.24: Tỷ lệ chết tích lũy của các lô tôm khi cảm nhiễm với WSSV ở nồng khác nhau là 2,6x105, 2,6x104, 2,6x103 và 2,6x102 copy/ml
Từ kết quả thu đƣợc chúng tôi xác định đƣợc liều LD75 nằm trong khoảng 2,6 x 104 đến 2,6 x 103
copy/ml. Để xác định chính xác hơn liều LD75 chúng tơi tiến hành thí nghiệm tƣơng tự với 4 nồng độ WSSV khác nhau (trong dãy 2,6 x 104 đến 2,6 x 103 copy/ml) là 2,6 x 104, 1,3 x 104, 0,65 x 104 và 0,3 x 104 copy/ml. Kết quả theo dõi tỷ lệ chết tích lũy của các lơ đƣợc thể hiện ở hình 3.25 và cho thấy ở ngày thứ 6, 86,7% tôm ở có nồng đô ̣ WSSV2,6 x 104 copy/ml bị chết, và đến ngày thứ 7, thì 100% tơm ở lơ này đều bi ̣ chết , cịn ở nồng độ WSSV 1,3 x 104 copy/ml, đến ngày thứ 7 có tới 76,7% bị chết. Từ kết quả thu đƣợc chúng tôi xác định đƣợc liều LD75 là 1,3 x 104 copy/ml và liều này đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu cƣờng độc về sau.
Hình 3.25: Tỷ lệ chết tích lũy của các lơ tơm khi cảm nhiễm với WSSV ở nồng độ khác nhau là 2,6 x 104
, 1,3 x 104, 0,65 x 104 và 0,3 x 104 copy/ml
3.3.3.3. Đánh giá khả năng bảo hộ của bào tử tái tổ hợp
Những nghiên cứu trƣớc đây đã chỉ ra rằng bảo vệ và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu có thể đƣợc cảm ứng ở động vật không xƣơng sống và đặc hiệu hơn cả là ở giáp xác [110], các đánh giá về sau đã chỉ ra rằng kháng nguyên chính của WSSV, VP28 có thể kích thích phản ứng miễn dịch kháng WSSV bằng con đƣờng uống hoặc tiêm [45, 114]. Nhằm xác định khả năng phòng bệnh đốm trắng ở tôm thẻ chân trắng bởi chế phẩm bào tử B. subtilis cotB-VP28 và cotB -GST-VP28, chúng
tơi đã bớ trí các lơ tơm thí nghiệm khác nhau, trong đó bao gờm các mẫu đối chƣ́ng âm (tôm không nhiễm WSSV ), đối chƣ́ng dƣơng (tôm cho nhiễm WSSV nhƣng ăn thƣ́c ăn khơng chƣ́a bào tƣ̉ ) và lơ thí nghiệm (tơm cho nhiễm WSSV nhƣng ăn thƣ́c ăn chƣ́a bào tƣ̉ PY79, hay cotB-VP28 hay cotB-GST-VP28).
Các nghiệm thức đƣợc cho ăn thức ăn tƣơng ứng sau 14 ngày, đƣợc công cƣờng độc với WSSV ở nồng độ 1,3x104
copy/ml. Tôm tiếp tục cho ăn thức ăn thử nghiệm tƣơng ứng và theo dõi số lƣợng tôm trong 14 ngày ngày tiếp theo.
Hình 3.26: Tỷ lệ chết tích lũy của các lơ tôm khi đánh giá khả năng bảo hộ của bào tử tái tổ hợp
Tỷ lệ chết tích lũy của các của các lô tôm thẻ chân trắng đối chứng âm Tỷ lệ chết tích lũy của các của các lô tôm thẻ chân trắng đối chứng dƣơng Tỷ lệ chết tích lũy của các của các lô tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp trộn bào tử PY79 với mật độ 109 CFU/g
Tỷ lệ chết tích lũy của các của các lô tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp trộn bào tử CotB-VP28 với mật độ 109 CFU/g
Tỷ lệ chết tích lũy của các của các lô tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn công nghiệp trộn bào tử CotB-GST-VP28 với mật độ 109 CFU/g
Kết quả thí nghiệm (Hình 3.26) cho thấy tôm ở các lô đối chƣ́ng dƣơng (sau khi công cƣờng độc với nồng độ WSSV là 1,3x104 copy/ml) có biểu hiện ăn ít và bắt đầu chết sau 2 ngày. Tỷ lệ chết tích lũy tăng nhanh từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 9
và tỷ lệ tơm chết tích lũy là 100% ở ngày 11 sau khi cƣờng độc. Tại các nghiệm thức thử nghiệm khi cho tơm ăn có bổ sung bào tử PY79, tơm thử nghiệm xuất hiện hiện tƣợng ăn ít ở ngày thứ 5. Tỷ lệ tơm chết tích lũy tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 11 sau cƣờng độc với WSSV. Tỷ lệ tơm chết tích lũy đạt 94,5% sau 14 ngày cƣờng độc với WSSV ở nồng độ là 1,3 x 104
copy/ml. Tơm chết có các dấu hiệu đặc trƣng của bệnh đốm trắng (bỏ ăn - thức ăn dƣ thừa nhiều, lƣời vận động, đỏ thân và một số xuất hiện đốm trắng ở dƣới mang) đồng thời có kết quả dƣơng tính khi tiến hành kiểm tra sự hiện diện của WSSV bằng phƣơng pháp PCR. Tại các nghiệm thức thử nghiệm cho ăn thức ăn trộn bào tử tái tổ hợp CotB-VP28, CotB- GST-VP28 và lô đối chứng âm tỷ lệ chết tích lũy sau 14 ngày theo ghi nhận đƣợc tƣơng ứng là 19,23%, 26,67% và 25,81%.
Mƣ́ c đô ̣ bảo bộ của các dạng bảo tử CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 ở mật độ bào tử 1 x 109
CFU/g thức ăn đối với tôm thẻ chân trắng khi công cƣờng độc với WSSV tƣơng ứng là 81% và 73,3%. Kết quả này chƣ́ng tỏ rằng bào tử B. subtilis
CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 đều có tiềm năng bảo vệ tôm chống lại WSSV. Ngồi ra, chúng tơi quan sát đƣợc lơ tôm cho ăn bào tử PY79 chết chậm hơn lô tôm ăn thức ăn không bổ sung bào tử, mặc dù tỷ lệ chết ở ngày 14 cũng lên tới 94,5%. Từ đó có thể nhận thấy rằng, bản thân bào tử vi khuẩn PY79 cũng có khả năng tăng cƣờng miễn dịch của tôm, giúp cho tôm làm chậm sự tấn công của virus đốm trắng. Số liệu tƣơng tự cũng cho thấy khả năng bảo vệ tôm chống WSSV thấp ở nhóm cho ăn tế bào sinh dƣỡng B. subtilis dại (20%) [34] và bào tử của chủng này (13%) [74].
Cho đến nay , phần lớn các kết quả nghiên cứu tạo các vaccine thế hệ mới có thể sử dụng qua đƣờng thức ăn đều đƣợc thiết kế dựa trên cấu trúc kháng nguyên VP28 của WSSV [16, 44, 70, 91, 114] và chứng tỏ có nhiều triển vọng . VP28 tái tổ hợp trộn với thức ăn tôm để thử nghiệm dạng vaccine đƣờng uống này cho tôm sú
P. monodon, P. (Marsupenaeus) japonicus thu đƣợc hiệu quả bảo vệ từ 30-70% tùy
thuộc vào hàm lƣợng VP28 cho tôm ăn và thời điểm nhiễm virus sau khi cho tôm ăn protein VP28 tinh sạch [16, 114]. Tuy nhiên, hiệu quả bảo vệ thu đƣợc giảm theo thời gian, nếu nhƣ không liên tục cho tôm ăn thức ăn chứa protein VP28. Kết quả
nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, khả năng bảo hộ của các dạng bảo tử B. subtilis CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 đối với tôm thẻ chân trắng ở mức lớn hơn 70% là tƣơng đối phù hợp với các cơng bố gần đây của nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng B.
subtilis có biểu hiện VP28 nhƣ một dạng vaccine qua đƣờng uống để phòng chống
nhiễm WSSV trong tôm nuôi. Fu và tập thể [34] đã tạo ra một chủng vi khuẩn B.
subtilis tái tổ hợp biểu hiện mạnh VP28 có khả năng bảo vệ miễn dịch tới 83%
chống lại WSSV ở một lồi tơm Trung quốc (F. chinensis) khi cảm nhiễm ở ngày thứ 14. Tuy vậy, khả năng bảo vệ miễn dịch chống lại WSSV vẫn bị giảm dần khi nhiễm virus từ tuần thứ 2 sau khi ngừng cho tôm ăn vi khuẩn tái tổ hợp chứa VP28. Ning và tập thể [74] đã phát triển B. subtilis tái tổ hợp biểu hiện VP28 và thu đƣợc mức độ bảo vệ khoảng 46-50% ở tôm Cambarus clarkii chống lại WSSV. Mặc dù vậy, Ning và tập thể [74] không đánh giá khả năng bảo vệ miễn dịch chống lại WSSV với L. vannamei cũng nhƣ không đánh giá các chỉ thị phản ánh tình trạng miễn dịch của tôm.
Mặt khác, kết quả nghiên cƣ́ u của chúng tôi cho th ấy hoạt độ PO và SOD tăng lên đáng kể trong cả ba nhóm tơm ăn thƣ́c ăn có chƣ́ a B. subtilis PY79, cotB-
VP28, hay cotB -GST-Vp28, và mức độ tăng rõ nét đối với tôm ăn bào tử CotB- VP28 và CotB-GST-VP28. Enzyme superoxide dismutase (SOD) vớ i hoa ̣t tính phân hủy gốc superoxide đƣợc sinh ra từ quá trình thực bào nhờ đó có thể đã tăng cƣờng khả năng tiêu diệt tác nhân gây bệnh. Ngoài ra PO là một enzyme chứa nguyên tử đồng (Cu), xúc tác tiếp theo 2 quá trình o-hydroxyl hoá monophenol và oxy hoá diphenol thành quinine, sau đó quinone sẽ đƣợc trùng hợp trong điều kiện khơng có enzyme thành melanine. Melanin sẽ bao lấy vi khuẩn hay vật lạ và phóng thích ra ngồi lớp vỏ cutin. Do dó hoạt độ của enzyme SOD, PO tăng là những tiêu chí đƣợc dùng để đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch của tơm khi đƣợc khích thích bởi các chế phẩm probiotic [98]. Sự khác nhau trong sự thay đổi hoạt độ enzyme PO và SOD có thể là do bào tử B. subtilis có khả năng kích thích hoạt động thực bào của các tế bào hyaline hơn là kích thích hoạt động chuyển hóa pro-PO thành phenoloxidase của các tế bào bạch cầu hạt ở tôm thẻ chân trắng, từ đó tăng hoạt
động enzyme SOD mạnh hơn so với enzyme PO. Bản thân PO là enzyme chính trong con đƣờng tổng hợp melanin, vì vậy có thể thúc đẩy phản ứng miễn dịch dịch thể trong máu. Tế bào máu đã đƣợc hoạt hóa cũng sản xuất thêm chất kháng khuẩn, nhƣ H2O2 và O2-, giúp tăng sự kháng bệnh, và O2- có thể bị phân giải nhanh chóng bởi SOD thành O2 và H2O. Trong mợt nghiên cƣ́u g ần đây, Tseng và tập thể chứng minh rằng tơm đƣợc cho ăn B. subtilis E20 có s ự tăng lên đáng kể về hoạt độ của
enzyme PO và SOD, glutathione peroxidase so với nhóm đối chứng [102]. Nhƣ vâ ̣y, có thể thấy rằng có sự liên quan khá chặt chẽ giƣ̃a khả năng k ích thích hoạt tính enzyme PO, SOD nhƣ các chỉ thi ̣ về đáp ƣ́ng miễn di ̣ch và mƣ́c đô ̣ đƣợc bảo hô ̣ khỏi sự tấn công của WSSV ở tôm thẻ chân trắng khi đƣợc ăn thức ăn có chứa bào tƣ̉ tái tở hợp B. subtilis CotB-VP28 và CotB-GST-VP28. Bào tử B. subtilis PY79 cho thấy không có khả năng bảo hô ̣ tôm khỏi sƣ̣ tấn công của WSSV nhƣng la ̣i có khả năng làm chậm quá trình chết của tôm. Tác dụng làm chậm này có thể liên quan đến khả năng làm tăng một phần hoạt đô ̣ PO và SOD ở tôm bởi bào tƣ̉ B. subtilis
PY79.
Nhìn chung lại, chúng tôi thấy rằng chế phẩm bào tử B. subtilis CotB-VP28 và
CotB-GST-VP28 tạo ra trong nghiên cứu này thể hiện tính bền với nhiệt , ổn định trong mô ̣t dải pH rô ̣ng (2-10), chịu đƣợc nồng độ muối cao (4%). Các chế phẩm này có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch ở tôm thẻ chân trắng và khi đƣợc trộn vào thức ăn nuôi tôm đã thể hiện khả năng bảo hộ tôm chống lại virus gây bênh đốm trắng ở mƣ́c đô ̣ tốt (trên 70%). Nhƣ̃ng tính chất mới của chế phẩm B. subtilis
CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 tạo ra là cơ sở để phát triển vaccine dạng probiotic dùng phịng bệnh đốm trắng cho tơm.
KẾT LUẬN
1. Đã nhân bản, nhân dòng và xác định trình tự gen mã hóa cho protein VP28 (615 bp) từ 23 mẫu tôm bị bệnh đốm trắng của các địa phƣơng khác nhau ở Việt Nam và phát hiện ra 5 sự sai khác về nucleotide (A125G, A183G, A226G, A403G, T517C) so với trình tự gen đã công bố (AY168644). Trong số các sai khác về nucleotide, có 4 sai khác dẫn đến sự sai khác về acid amin.
2. Đã biểu hiện thành cơng gen mã hóa VP28 ở E. coli dƣới dạng VP28-His- tag và tạo đƣợc bào tử B. subtilis tái tổ hợp với sự biểu hiện VP28, GST-VP28 trên bề mặt bào tử dƣới dạng dung hợp với CotB của B. subtilis.
3. Bào tử tái tổ hợp B. subtilis cotB-VP28 và cotB-GST-VP28 đƣợc tạo thành
tối ƣu trong môi trƣờng DSM sau 48 giờ và đạt mật độ tƣơng ứng là 3,1 x 109/ml, 4,2 x 109/ml, bền ở nhiệt độ 80oC, nồng độ muối 4% và chịu đƣợc pH trong khoảng từ 2-10, có thể bảo quản ở điều kiện khơ ráo ở nhiệt độ ngồi trời (25-37oC) trong vòng 3 tháng.
4. Đã xác định đƣợc dạng thức ăn, cách thức cho tôm ăn thức ăn trộn bào tử B.
subtilis tái tổ hợp và chứng minh sự tồn tại của bào tử trong ruột tôm.
5. Thử nghiệm bƣớc đầu cho thấy bào tử B. subtilis dạng mang CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 có khả năng làm tăng hoạt độ phenoloxidase và superoxide dismutase ở tôm thẻ chân trắng và có khả năng bảo vệ tơm này chống lại WSSV ở mức bảo hộ tƣơng ứng là 81% và 73,3%.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm của bào tử B. subtilis cotB-VP28 và cotB-GST-VP28.
DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Pham Kien Cuong, Bui Thu Thuy, Nguyen Viet Dung, Bui Thi Ngoc
Anh, Nguyen Thi Van Anh, Simon Cutting, Phan Tuan Nghia (2012), "Polymorphism analysis of capsid protein VP28 encoding gene of white spot syndrome virus isolated from Penaeus monodon shrimp in Viet Nam", VNU Journal of Science 28(2S), pp 88-95.
2. Nguyen T. V. A., Pham K. C., Pham T. T. H., Pham L. H., Nguyen H. A., Dang T. L., Huynh A. H., Cutting S., Phan T. N. (2014), "Bacillus
subtilis spores expressing the VP28 Antigen: A potential oral treatment to protect Litopenaeus vannamei against white spot syndrome", FEMS Microbiology Letters
358, pp 202–208.
3. Phạm Kiên Cƣờng, Bùi Thị Ngọc Ánh, Trần Thị Thanh Quỳnh, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Thị Việt Hà, Phạm Thị Lƣơng Hằng, Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Hòa Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2014), "Nhân dịng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus đốm trắng trên lớp áo ngoài của bào tử B. subtilis", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 12(2), pp 247-253.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng Việt
1. Đoàn Văn Cƣờng, Phạm Thị Tuyết Anh, Ngô Xuân Tuyến, Nguyễn Văn Hảo (2007), "Xác định quá trình phát sinh bệnh của virus gây hội chứng đốm trắng",
Tuyển tập nghề các sông Cửu Long, pp. 265-278.
2. Nguyễn Viết Dũng, Ngô Xuân Tuyến, Phạm Võ Ngọc Ánh , Trƣơng Hồng Việt, Nguyễn Văn Hảo (2007), "Đặc trƣng bộ gen và hình thái của virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú nuôi Penaeus monodon phân lập tại Việt Nam", Tạp chí Viện nghiên cứu ni trơng thủy sản II, pp. 222- 230.
3.Huỳnh Trƣờng Giang, Vũ Ngọc Öt, Trƣơng Quốc Phú (2011), "Sử dụng chiết suất β-Glucan từ rong biển để tăng sức đề kháng của tôm biển: Tổng quan", Kỷ yếu
Hội nghị Khoa học thủy sản lần 4, pp. 103-113.
4. Nguyễn Văn Hảo, Lâm Trâm Anh, Phạm Thị Tuyết Anh, Đồn Văn Cƣờng, Ngơ Xuân Tiến, Nguyễn Thị Hiền (2007), "Xây Dựng mô hình gây bệnh thực nghiệm chuẩn đối với bệnh đốm trắng trên tôm sú Penaeus monodon", Tuyển tập nghề các sông Cửu Long, pp. 257-264.
5. Trần Thị Minh Tâm (1999), "Bệnh thường gặp ở tôm phương pháp chẩn đoán và