2.1 Mẫu bùn hồ
Mười ba mẫu bùn được lấy từ ba hồ A, B, C. Hai mẫu B1 và B2 được lấy ở hồ B và mẫu C1 được lấy ở hồ C ở thời điểm 3/2007. Đây là 2 hồ khơng nhận trực tiếp nguồn nước chảy từ các bãi nhiểm nặng chất diệt cỏ chưa dioxin ở khu vực sân bay Đà Nẵng. Hồ A là hồ tiếp nhận trực tiếp nguồn nước từ khu vực bãi nhiểm. Năm mẫu bùn A1-A5 ở hồ A được lấy ở thời điểm 1/2007 và năm mẫu A6-A10 được lấy ở thời điểm 3/2007. Nồng độ dioxin trong một số mẫu lấy ở hồ B và C khơng cao, tuy nhiên ở hồ A khoảng 10.000ppt.
2.2 Xác định tập đồn vi khuẩn KSF bằng kĩ thuật PCR-DGGE a, Tách chiết và làm sạch DNA
1)Dung dịch đệm tách gồm: TrisHCl (pH = 8.0) 100 mM; EDTA (pH = 8.0) 100 mM; Natriphosphate (pH = 8.0) 100 mM; NaCl 1,5 M; CTAB 1%.
2)Trộn 15ml dung dịch đệm tách với 15g đất.
3)Lắc đều trong 15 phút trên máy lắc với tốc độ 200 rpm. 4)Mẫu cho shock nhiệt 3 lần trong nito lỏng và bể nhiệt 65ºC.
6)Bổ sung 1,5 ml SDS 20% vào tất cả các mẫu, lắc đều và ủ ở 65ºC trong 2 giờ. Ly tâm 6000 rpm trong 10 phút thu dịch bên trên. Phần tủa cịn lại, bổ sung tiếp 4,5 ml đệm tách và 0,5 ml SDS 20 %, tiếp tục ủ ở 65ºC thêm 10 phút.
7)Lặp lại quá trình ly tâm như trên để thu dịch.
8)Phần dung dịch chứa DNA thu được sau hai lần ly tâm đĩ được làm sạch với chloroform/ isoamyl alcohol (24 : 1).
9)Kết tủa DNA bằng isopropanol, rửa sạch bằng ethanol 70 % và hịa tan trở lại bằng 100 µl dung dịch TE 10 mM.
10) Thu nhận được dung dịch DNA rồi tiếp tục làm sạch bằng phenol, đem kết tủa và hịa tan trở lại bằng 50 µl dung dịch TE 10 mM.
b. Sử dụng kỹ thuật PCR lồng nhân đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn KSF
1)DNA tổng số của 13 mẫu bùn hồ được tách chiết và làm sạch, bảo quản ở -20ºC đến khi sử dụng.
2)Đoạn gen mã hĩa 16S rRNA của vi khuẩn KSF được nhân lên nhờ kỹ thuật PCR lồng. Đầu tiên, đoạn gen gần 1.500 bp của vi khuẩn được nhân lên bừng phản ứng PCR với DNA tổng số mẫu bùn, cặp mồi 27F và 142R. Phản ứng PCR tiếp theo sử dụng DNA khuơn từ sản phẩm PCR kể trên với cặp mồi đặc hiệu (DCC305GC và DSV838) cho một số nhĩm vi khuẩn KSF.
3)Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: 94- 4 phút, 94- 1 phút, 57- 1 phút, 72- 1 phút, lặp lại 35 chu kỳ, 72- 8 phút.
4)Giữ sản phẩm PCR ở 4. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,8 %, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới UV.
c. DGGE
50 µl sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA nhĩm vi khuẩn KSF được tra vào các giếng trên gel acrylamide/bisacrylamide với dải nồng độ chất biến tính
urea/formamide, điện di, nhuộm DNA trong gel với ethidium bromide,kiểm tra dưới UV.