ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.3. Thực hiện PCR:
2.4.3.1. Chạy PCR trên máy
Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích 10µl gồm: ST T Thành phần Thể tích (µl) 1. DNA (50ng/ µl) 2 2. GOLTAQ 5
3. Mồi xuôi (5pmol/µl) 1
4. Mồi ngược (5pmol/ µl) 1
5. Nước 1
Tổng thể tích 10
- Hỗn hợp phản ứng được cho vào máy chạy PCR đã được cài đặt chu trình nhiệt: 950C : 5 phút 950C : 1 phút 590C : 1 phút x 35 chu kỳ 720C : 2 phút 720C : 5 phút 150C
2.4.3.2. Điện di DNA trên gel agarose
- Chuẩn bị gel agarose 1% (đoạn gen kích thước khoảng 1kb)
+ Cho 15ml TBE 1X (pha từ đệm TBE 10X ban đầu) + 0.15g agarose đươc hỗn hợp Z
+ Đun hỗn hợp Z bằng lò vi sóng tới khi dung dịch trong suốt.
+ Đổ gel vào khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng (8 giếng). + Để 30 phút tới khi gel đông đặc hoàn toàn.
+ Bản gel điện di phải có độ dày khoảng 3 - 4 mm và được ngâm chìm hoàn toàn trong bể điện di đã đổ sẵn đệm TBE.
- Chuẩn bị mẫu điện di:
+ Nạp 5µl sản phẩm khuếch đại PCR vào các giếng trên bản gel. + Nạp 5 µl thang DNA chuẩn (marker) loại 100bp.
- Chạy điện di:
Tiến hành điện di mẫu DNA bệnh cùng với thang DNA chuẩn trong 30 phút ở hiệu điện thế 90V.
- Nhuộm bản gel điện di:
Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm ethidium bromide trong 5 phút.
Rửa bản gel bằng nước để loại bỏ phần ethyldium bromid dư. - Chụp ảnh gel:
Bản gel sau khi nhuộm với ethyldium bromid được soi bằng đèn tử ngoại (UV). Quan sát các vạch sáng của DNA xuất hiện trên bản gel và chụp hình để lưu trữ kết quả. 2.4.4. Giải trình tự: 2.4.4.1. Thực hiện phản ứng PCR giải trình tự - Thành phần của 1 phản ứng: STT Thành phần Thể tích (µl) 1. DNA 0.5
2. Buffer 1.5
3. BD 1
4. Mồi 0.5
5. Nước cất 2 lần 6.5
Tổng thể tích 10
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự: 960C : 1 phút 960C : 10 giây 500C : 5 giây x 25 chu kỳ 600C : 4 phút 150C Bảo quản ở 40C 2.4.4.2. Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự:
Sản phẩm PCR giải trình tự được tinh sạch bằng phương pháp tủa Ethanol: - Thêm vào ống hỗn hợp phản ứng:
+ 64 µl Ethanol lạnh 95% + 26 µl nước.
- Ly tâm 15000 vòng/phút x 15 phút ở nhiệt độ phòng. - Hút bỏ dung dịch giữ lại tủa DNA ở đáy ống.
- Thêm 250 µl Ethanol lạnh 70% (-20 ºC). Trộn đều rồi để nhiệt độ phòng. - Ly tâm 15000 vòng/phút x 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Để khô hoàn toàn.
- Thêm 20 µl Hi-Di. Trộn đều (votex nhẹ) - Để ở 95oC trong 2 phút.
- Làm lạnh trong 5 phút, votex rồi chuyển sang giải trình tự bằng máy ABI 3100.
2.4.4.3. Giải trình tự trực tiếp
Các đột biến trên toàn bộ gen COL1A1 được phát hiện bằng giải trình tự trực tiếp trên máy ABI-3100 (Applied Biosystem) tại Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein Trường Đại học Y Hà Nội, và được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench. Các kết quả trình tự gen COL1A1 của mẫu đối chứng và mẫu bệnh nhân sẽ được so sánh với trình tự chuẩn của gen COL1A1 trên Gene Bank (GenBank Accession number NG_007400.1 đối với DNA).