Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.7.1.Tách chiết RNA mẫu Ong
Quy trình tách chiết RNA tổng số bằng TRIzol-LS:
Mẫu ựược tách triết theo phương pháp cá thể, mỗi mẫu là một ấu trùng tuổi lớn. Do mẫu ựược bảo quản bằng cồn nên phải làm sạch cồn bằng nước cất trước khi tách triết RNA tổng số. Bằng cách ngâm mỗi mẫu trong khoảng 15ml nước cất trong khoảng 15-20 phút một lần (từ 2-3 lần). Sau ựó ựặt mẫu ấu trùng lên giấy thấm ựể loại hết phần nước bên ngoàị Bỏ mẫu vào các tube 1,5ml ựã ựược ựánh số thứ tự theo mẫụ
- Bước 1: Nghiền mẫu ấu trùng trong 750 ộL dung dịch TRIzol-LS (Nghiền
cho tới khi mẫu và dung dịch ựồng nhất)
- Bước 2: để mẫu ựã nghiền ựồng nhất ở nhiệt ựộ phòng trong khoảng 15 phút - Bước 3: Ly tâm mẫu trong 10 phút (12000g và 4ỨC) sau ựó thu lấy dịch trong phắa trên sang tube mới
- Bước 4: Thêm 200 ộL Chloroform:Isoamyl (24:1) ựảo ựều bằng tay hoặc
- Bước 5: Ly tâm mẫu trong 15 phút (12000g và 4ỨC) sau ựó thu dịch trong phắa trên sang tube mới (Chú ý: bước này phải cẩn thận không ựược hút lẫn lớp dịch phắa dưới và lớp tủa ở giữa vì chỉ dắnh một chút cũng làm cho RNA tổng số bị nhiễm bẩn, ảnh hưởng ựến phản ứng sau này)
- Bước 6: Thêm 500 ộL Iso-propanol ựảo ựều tube bằng tay và giữ mẫu trong tủ lạnh trong 15-20 phút
- Bước 7: Ly tâm 10 phút (12000g và 4ỨC) thu lấy cặn RNA tổng số
- Bước 8: Rửa cặn hai lần bằng ethanol 75%
- Bước 9: để cặn RNA khô tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng trong khoảng thời gian 30 phút (để ở nơi thoáng mát và sạch sẽ)
- Bước 10: Hòa tan cặn RNA bằng 25 ộL nước RNase-free và bảo quản ở -80
ỨC. Tuy nhiên RNA chiết ựược có thể bảo quản tạm thời ở -20 ỨC trong thời gian ngắn.