2.1 V t li u
2.1.1 Gi ng lúa IR64 (OM89):
Gi ngălúaăIR64ăđ c cung c p b i Công ty C ph n Gi ng nông nghi pă i n Biên.
2.1.2 Oligochitosan:
Oligochitosan tr ngă l ng phân t 5.994 Da t dung d ch chitosan 8B (Funakoshi ậ Tokyo, Nh t B n) 5%, đ deacetylăh́aă80%,ăđ c phân c t b i tia b c x gamma li u x 150 kGy (cung c p b i phịng thí nghi m Công ngh Sinh h c V t li u và Nano thu c Trung tâm Công ngh Sinh h c thành ph H Chí Minh). N ng đ dung d ch oligochitosan s d ng xuyên su t các thí nghi m là 75 ppm.
2.2ăPh ngăphápăth́ nghi m
22
7 ngày, chi u sáng 2500 lux, nhi tăđ 30oC H t lúa IR64
Kh trùng
Ngâm h t v iăn c c t
Chuy năsangăđ aăpetriă trong t i 4 ngày
Ch n cây m lúa kh e
Chuy năsangăcácăh ă th y tinh
Theo dõi các ch tiêu
X lý s li u
K t lu n
Hình 2.1: S ăđ quy trình th c hi n thí nghi m
Javel 15% trong 15 phút 24 gi , t i aăpetri lót gi y th m đ c làm m v i n c c t R dài t 2-3 cm V i 4 nghi m th c: 1. N c c t 2. NaCl 0,6% 3. Oligochitosan 75 ppm 4. NaCl 0,6% và Oligochitosan 75 ppm 1.Hình thái 2.Sinh lý 3.Sinh hóa 4.Gene
23 2.2.1 T o h t lúa n y m m in vitro
M c tiêu: T o nguyên li u kh iăđ u cho các thí nghi m kh o sát.
Ph ngăpháp: H tălúaăđ c kh trùng v i javel 15 % trong 20 phút, r a s ch v iăn c c t. Ngâm h tătrongăn c c t trong 24 gi . Sauăđ́ăđ t h t trên gi y th m đ c làm m v iăn c c tătrongăđ aăPetriăđ ng kính 15 cm,ătrongăđi u ki n t i 25
2oC trong 4 ngƠyăđ n y m m. Cây m lúa có chi u dài r m m t 2 ậ3ăcmăđ c s d ng s d ng cho các thí nghi m kh o sát ti p theo. Quá trình t o nguyên li u cho thí nghi măđ c th c hi nătrongăđi u ki n vô trùng.
2.2.2 Th́ nghi m kh o sát nh h ng c a oligochitosan lên kh n ng đáp ng v i stress m n c a cây m lúa in vitro
2.2.2.1 M c tiêu: Xácăđ nhătácăđ ng h tr c a oligochitosan lên kh n ngăkhángăm n (NaCl 0,6%) c a cây m lúa in vitro. m n (NaCl 0,6%) c a cây m lúa in vitro.
2.2.2.2 Ph ngăpháp: h tălúaăđưăn y m m đ c chuy n sang h ăth y tinh (đ ng kínhăđáyă6,4ăcm,ăchi u cao 11,8 cm) v i m tăđ 20 h t/h ch a 20 mL dung d ch b trí theo 4 nghi m th c:
(1)ăN c c t (đ i ch ng âm) (2) NaCl 0,6% (đ i ch ngăd ng) (3) OC 75 ppm
(4) OC 75ppm/NaCl 0,6%.
Các thí nghi măđ c b trí hồn tồn ng u nghiên, m i nghi m th c l p l i 3 l n, m iăh ăcó 20 cây. Thí nghi măđ c th c hi n đi u ki n chi u sáng 2500 lux vƠ nhi tăđ 30 ± 2oC.
Các ch tiêuăđ c theo dõi sau 7 ngày t khi cây m lúaăđ c chuy n sang nuôi trongăh ăth y tinh:
− Hình thái: s l ng lá, chi u dài lá, chi u r ng lá, s l ng r , chi u cao cây, quan sátăd i kính hi năviăđi n t quét (SEM).
− SinhălỦ:ăc ngăđ quang h păvƠăc ngăđ hô h p c a lá.
− Sinh hoá: t l tr ngăl ng khô/tr ngăl ngăt i,ăhƠmăl ngăđ ng t ng s , hàm l ngăproline,ăhƠmăl ng protein t ng s , hƠmăl ng di p l c t a, di p l c t b, hàm l ng carotenoid và ho t tính enzyme ascorbate peroxydase.
24
− Phân t : m căđ bi u hi n c a gene liênăquanăđ n t ng h p proline P5CS và P5CR, geneăliênăquanăđ n t ng h p enzyme ascorbate peroxidase (APX) là Cytosolic APX, Thylakoid bound- APX, Stroma APX.
2.2.2.3 Ph ngăphápăth c hi n:
a. Ch tiêu hình thái:
− S l ngălá:ăđ m t t c các lá m có chi u dài t 1 cm.
− S l ng r :ăđ m t t c các r nhô ra kh i g c thân t 1 mm.
− Chi u dài lá:ăđoăt ch́păláăđ n g c lá c aăláăđ u tiên m
− B r ng lá:ăđoăb r ng l n nh t c a lá m đ u tiên
− Chi u cao cây: đoăchi u dài t ch́păláăđ n g c thân
− Hình thái: s d ng kính hi năviăđi n t quét (SEM): Model S ậ 400, hãng Hitachi, Nh t B n đ quan sát hình thái gi i ph u c a lá (th c hi n t i Trung tâm Nghiên c u ậ Tri n khai Khu Công ngh cao TP.HCM).
b. Ch tiêu sinh lý:
− C ngăđ hô h p:ăC ngăđ hơ h p (µmol O2/g tr ngăl ngăt i/phút) c aăláăđ c xácăđnh b ngăđi n c c oxygen d a trên s gi m oxygen trong bu ngăđoă(LeafLab2,ă Hansatech) theo th i gian, 27oC, trong t i.
− C ngăđ quang h p:ăC ngăđ hơ h p (µmol O2/g tr ngăl ngăt i/phút) c a lá đ că xácă đnh b ngă đi n c c oxygen d a trên s thoát oxygen trong bu ngă đoă (LeafLab2, Hansatech) theo th iăgianătrongăđi u ki n chi u sáng 10.000 lux, 27oC (đoăt i phịng thí nghi m Sinh lý Th c v t - i h c Khoa h c T nhiên)
c. Ch tiêu sinh hóa:
− T l ch t khơ: Cân cây m b ngăcơnăphơnătíchăćăđ chínhăxácă0,001găđ xácăđnh tr ngăl ngăt i,ăsauăđ́ăđ t cây vào t s y 80°Căđ n khi tr ngăl ngăkhôngăđ i. Tr ngăl ng khô c a cây m đ căxácăđ nh b ngăcơnăphơnătíchăćăđ chính xác 0,001g.
T l ch tăkhơăđ c tính theo cơng th c:
� � [2.1]
25
C ăs ph ngăpháp: Ph ngăphápăxácăđ nhăhƠmăl ng s c t b ngăđoăquangă d a vào tính ch t h p th n ngăl ng ánh sáng ch n l c c a di p l c t (vùng ánh sáng xanh :ă430ăậ 460 nm;ăv̀ngăánhăsángăđ :ă620ă- 700 nm) và kh n ngăh̀aătană trong dung môi ethanol.
Ti n hành: Cân lá cây, nghi n nát trong c i v i 10 mL dung d ch ethanol 96%,
l c nhanh d ch chi tăvƠoăbìnhăđ nh m căvƠăđnh m c thành 25 mL. Dung d ch sau khi đnh m căđ căđo OD cácăb c sóng l năl t là 470 nm, 649 nm và 665 nm.
Tính tốn: HƠmăl ng s c t đ c tính tốn d aătrênăđnh lu t Lambert ậ Beer (A = x C x d), c th v i giá tr chi u r ng cuvette là 1 cm, thì cơng th c tính hàm l ng các s c t (µg/mL)ănh ăsau:
C = 13.36 x A665 ậ 5.19 x A649 [2.2]
C = 27.34 x A649 ậ 8.12 x A665 [2.3]
CCar = [2.4]
Trongăđ́:ă
C , C , CCar (µg/mL) l năl tălƠăhƠmăl ng di p l c t a, b và carotenoid AălƠăđ h p th cácăb c sóng 470, 649, 665 nm.
HƠmăl ng s c t đ c chuy n t đ năv µg/mLăsangăđ năv µg/g tr ngăl ng t iătheoăcôngăth c sau:
HƠmăl ng s c t (µg/g) = Hàm � ng � c � g mL í ã [2.5]
V i: Th tích pha lỗng là 25 (mL) và tr ngăl ngăt iăm (g).
− HƠmăl ng proline (trong r và lá): đ c xácăđnh b ng phépăđoăm tăđ quang d aătrênăph ngăpháp c a Carillo (2014) [34].
C ăs ph ngăpháp:Ph ngăphápăs d ng ninhydrin (2,2- dihydroxyindane- 1,3-dione, s hi u CAS 485-47-2) vƠămáyăđoăquangăph cuvetteăđ xácăđnh hàm l ng proline có trong các m u mơ th c v tătrongăđi u ki n stress d a trên ph n ng t o s n ph m ć mƠuăđ pH acid c a ninhydrin vƠ v̀ng ch a nh́m N c a proline.
Ti n hành:
B c 1 ậ Chu n b nguyên li u và thu c th :
26
• Aceticăacidăb ngă(aceticăacidănguyênăch t khơng pha lỗng)
• Ethanol 98%
• Thu c th (pH th p): ninhydrin 1% (w/v) trong acetic acid 60% (v/v), ethanol 20% (v/v). Dung d ch c n tránh ánh sáng và năđ nh trong 24 gi .
B c 2 ậ X lý m u và chi t proline:
Prolineăđ c chi t xu t b ngăcáchăđunăńngăcácăm u mô (r vƠ lá) c a nguyên li u th c v t trong h n h păethanol:n c 70:30 (v/v) trong 30 phút. D ch chi tăđ c pha loãng 10 ậ 50 l n tr ngăl ngăt iă(w/v)ăv i h n h păethanol:n c 70:30 (v/v).
Dung d ch chu n: dung d ch proline (d ngăđ ng chu n)ăđ c pha loãng b ng h n h păethanol:n c 70:30 (v/v) các n ngăđ 5/2/1/0,5/0,2 mM.
B c 3 ậ nhăl ng proline:
Quy trình th c hi n d ngăđ ng chu n eppendorf 2mL vƠđ nhăl ng proline trong m u th c v t trong ng th y tinh có n p (12 mL) l năl t theo mô t trong b ng 2 (ph l c 1) v i các ng 1 ậ5ăđ d ngăđ ng chu n.
B c 4 ậ Tính tốn:
Ph ngăphápăxácăđ nhăhƠmăl ng proline b ngămáyăđoăquangăph cuvette có m i quan h tuy n tính gi aăhƠmăl ngăprolineăvƠăđ h p th t ngă ng n m trong kho ng 1 ậ 100 nmol.
Hàm l ng proline trong m u th c v tăđ c tính theo cơng th c sau:
Hàm � ng ��o�ine Đ (nmol/mg) [2.6]
Trongăđ́:ă
• AM (Å):ăđ h p th t iăb c sóng 520 nm c a m u d ch chi t
• Ablank (Å):ăđ h p th t iăb c sóng 520 nm c a m u tr ng
• d că(Å/nmol):ăđ căxácăđ nh b ngăph ngăphápăh i quy tuy n tớnh
ã 500 (àL): Th tớch d ch chi t s d ng
• 1500 (µL): T ng th tích dung d ch cu i cùng
• n:ă pha loưng c a dung d chăđemăđiăđ nhăl ng
27
− HƠmăl ngăđ ng t ng: HƠmăl ngăđ ng t ng ć trong lá vƠ r cây m lúaăđ c xácăđnh b ng cách tách chi t các phân t đ ng tan trong m u th c v t [35] vƠ đ nhăl ng các phân t đ ngătheoăph ngăpháp phenol ậ sulfuric acid.
C ăs ph ngăpháp: Carbohydrate h̀a tan d ngămonomerăsauăkhiăđ c tách t m u th c v t tham gia ph n ng v i sulfuric acid t o thƠnh các furfuraldehyde, trong khi d ng polymer b acid phân c t thƠnh các monomer. Các d n xu t nƠy furfuraladehyde nƠy ti p t c tham gia ph n ng v i phenol t o thƠnh các h p ch t ć mƠu vƠ ć th đ nhăl ngăđ c b ng ph ngăphápăđoăm tăđ quang b c śng 490 nm.
Ti n hƠnh:
B c 1 ậ Chi t xu tăđ ng h̀a tan t m u th c v t
Cân kh iăl ng m u mô th c v t (lá vƠ r ),ăđunăv i 5mL ethanol 96% (v/v) 95oC trong 30 phút. LƠm l nh dung d ch v nhi tăđ ph̀ng vƠ ly tâm 4000 v̀ng/phút trong 5 phút. Lo i b ph n d ch n i vƠ r a ph n bư 2 l n v iăn c c t. Thêm 3 mL n c c t vƠđunăsôiă 95oC trong 2 ti ng. Ph n d ch n iăthuăđ c ti n hƠnh pha loưng đ n n ngăđ thích h p vƠ chuy năsangăb căđ nhăl ng.
B c 2 ậ nhăl ngăđ ng h̀a tan trong dchăthuăđ c
Quy trình d ngăđ ng chu n vƠđ nhăl ng đ ng h̀a tan trong m u th c v t th c hi n trong ng th y tinh có n p (25 mL) l năl t theo mô t trong b ng 3 (ph l c 1) v i các ng 1 ậ8ăđ d ngăđ ng chu n.
B c 3 ậ T́nh toán
HƠmăl ngăđ ng h̀a tan trong m u th c v tăđ c xácăđ nh theo công th c:
Hàm � ng đ ng n (àg/g) [2.7]
Trong:
ã AM (Å):ăđ h p th t iăb c sóng 490 nm c a m u d ch chi t
• Ablank (Å):ăđ h p th t iăb c sóng 490 nm c a m u tr ng
ã d c (/àg/mL): cxỏcnh b ngăph ngăphápăh i quy tuy n tính
• n:ă pha loưng c a dung dchăđemăđiăđ nhăl ng (n = 5)
28
• Tr ngăl ngăt iă(g):ăkh iăl ng m u th c v tăđemăđiăchi t.
− HƠmăl ng protein t ng: đ c xácăđ nh b ng cách tách chi t protein ć trong m u th c v t [36] vƠđ nhăl ng b ngăph ngăpháp Bradford [37].
C ăs ph ngăpháp: Ph ngăphápăđ nhăl ng protein c a Bradford d a trên liên k t gi a d ng anion c a thu c nhu m Coomassie blue G250 v i g c arginyl c a proteină(nh ngăkhôngăliênăk tăđ c v i amino acid t do) vƠđ c xácăđnh b ng m t đ quang b c śng 595 nm.
Ti n hƠnh:
B c 1 ậ Tách protein ra kh i m u th c v t
Cân kh iăl ng m u lá cây m lúa,ăđunăv i 5 mL ethanol 96% (v/v) 95oC trong 30 phút. LƠm l nh dung d ch v nhi tăđ ph̀ng vƠ ly tâm 4000 v̀ng/phút trong 5 phút. Lo i b ph n d ch n i vƠ r a ph n bư 2 l n v iăn c c t. Thêm 5 mL NaOH 0,1N vƠđ yên nhi tăđ ph̀ng trong 30 phút. Ly tâm 4000 v̀ng/phút trong 2 phút. Ph n d ch n iăthuăđ c pha loưngăđ n n ngăđ thích h p vƠ chuy năsangăb căđ nh l ng.
B c 2 ậ nhăl ng protein t ng trong dchăthuăđ c
Quy trình d ngăđ ng chu n vƠ đ nhăl ng protein trong m u lá cây m lúa th c hi n trong ng th y tinh có n p (25 mL) l năl t theo mô t trong b ng 4 (ph l c 1) v i các ng 1 ậ 4 đ d ngăđ ng chu n.
B c 3 ậ T́nh toán
HƠmăl ng protein trong m u th c v tăđ c xácăđnh theo công th c:
Hàm � ng ��o�ein Đ n (àg/g) [2.8]
Trong:
ã AM (Å):ăđ h p th t iăb c sóng 595 nm c a m u d ch chi t
• Ablank (Å):ăđ h p th t iăb c sóng 595 nm c a m u tr ng
ã d c (/àg/mL): cxỏcnh b ngăph ngăphápăh i quy tuy n tính
• n:ă pha loưng c a dung d chăđemăđiăđ nhăl ng
• 5 (mL): th tích dung d ch NaOH 0,1N s d ngăbanăđ uăđ chi t m u th c v t
29
− Ho t tính enzyme ascorbate peroxidase (APX): đ căxácăđ nhătheoăph ngăphápă c a Nakano và Asada (1981) [38].
Ti n hành:
B c 1 ậ Ly trích enzyme APX:
Cân 0,02 g nguyên li u th c v tă t iă nghi n trong 1 mL dung dchă đ m phosphat 50 mM l nh pH 7 ch a 1% PVP40 (Polyvinylpyrrolidone 40), 0,2 mM EDTA và 5 mM ascorbate (vitamin C). Các ch t chi t xu tăđ c ly tâm trong 5 phút
3°C v i t căđ 13.000 vòng/phút.
B c 2 ậ nhăl ng:
H n h p ph n ng g m 50ămMăđ m kali photphat pH 7, 0,2 mM ascorbate, và 0,2 mM hydro peroxide trong t ng th tích 180 µL, dùng pipet l y 10 µL d ch chi t m uăđ b tăđ u ph n ng.ă h p th b căśngă290ănmăđ c ghi l i trong 130s.
B c 3 ậ Tính tốn:
Ho tăđ ngăAPXăđ c tính tốn theo Maksimovic và Zivanovic; m tăđ năv APXăđ căđ nhăngh aălƠăl ng enzyme có th oxy hóa 1 µmol acid ascorbic m i phút.
Ho t tính enzyme (U/L) [2.9] Ho t tính enzyme (U/gm u) = í [2.10] Trongăđ́:ă • Abs: đ gi m c a OD gi a 2 l năđo • Vt ng: th tích ph n ng (L) • t: th i gian gi a 2 l năđo (phút) • = 2,8 mMứ1 cmứ1: h s extinction coefficient c a ch t n n • Vm u: th tích d ch chi t s d ngăđ ph n ng (L) • Vd ch chi t: th tích d ch chi t t ng (L) • mm u: kh iăl ng m u (g) d) Ch tiêu phân t :
M cătiêu:ăđánhăgiáăm căđ bi u hi n hai gene m căđ phiên mã liênăquanăđ n t ng h p proline là P5CS (pyrroline-5-carboxylatesynthetase) và P5CR (pyrroline-5-
30
carboxylate reductase) và ba gene liênăquanăđ n t ng h p enzyme ascorbate peroxidase là Cytosolic APX (cAPX), Thylakoid - bound APX (tAPX) và Stromal APX (sAPX) đ c phân tích b ngăk ăthu t qRT-PCR.
Nguyên t c: d a vào l ng mRNA c a 5 gene m c tiêu các nghi m th c kh o sát đ so sánh m căđ ho tăđ ng c aăgeneătrongăđi u ki n m n khi có và khơng có m t oligochitosan (th c hi n t i cơng ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa).
Ph ngăphápătínhăm căđ bi u hi n gene: s d ngăph ngăphápă2-CT tính tốn m căđ bi u hi n thông qua ch s chu k ng ng (CT) [39].
Trongăđ́:
− CT = CTm i gene m c tiêu ậ CTm i OsActin
− CT = CT ậ CTcontrol
− CTcontrol: CT c a nghi m th căn c c t
− M căđ bi u hi n gene so v iăđ i ch ng = 2-CT
B ng 2.1: Trình t c p m i [40]
Tên Trìnhăt ă(5’-3’)
P5CS_F CAAATGCTCCTTTTAGCCTGTT P5CS_R GCGTTGGTACACAAGTTCTCAG P5CR_F AATAGAGGCCATGGCTGATG P5CR_R AATGCACCCTTCTCAAGCTC Cytosolic_APX_F GACAAGAAACCCTCTGCAGTTT Cytosolic_APX_R GTAGTCTGCTGGTTCACACTGG
Thylakoid_bound APX_F ATTTTCACTGGACGATGAACCA
Thylakoid_bound APX_R GGAAGTAGTTGGACTGCAGAGG Stromal APX_F GTCTGGAGCACATACACTTGGA
31
2.3 Ph ngăpháp phân t́ch th ng kê
Ph ngăpháp phân tíchăph ngăsaiă1ăchi uă(ANOVA)ăđ c áp d ngăđ x lỦ d li u k t qu b ng ph n m m Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) phiên b n 26. Th nghi m nhi u ph m vi c aăDuncanăđ c s d ngăđ ch ng minh s khác bi t ćỦ ngh a v m t th ng kê gi a các nghi m th c pă≤ă0,05.ăK t qu đ c th hi năd i d ng s trung bìnhă±ăđ l ch chu n (n = 60 cho ch tiêu hình thái vƠ n = 3 cho các ch tiêu c̀n l i).
32
CH NGă3:ăK T QU VÀ BÀN LU N
3.1 K t qu
3.1.1 S bi n đ i hình thái cây lúa trong đi u ki n m n
Trongăđi uăki n m nă(NaClă0,6%),ăcơyăm ălúaăb ă căch ăsinhătr ngănh ngăs ă hi nădi năc aăoligochitosanăđưăgiúpăc iăthi nătìnhătr ngănƠy.ăK tăqu ă ăb ngă3.1ăchoă th yăcơyăm ălúaătrongăđi uăki năm năćăcácăch ătiêuăsinhătr ngănh ăs ălá,ăs ăr ăvƠă chi uăr ngăláăđ uăgi măsoăv iăđ iăch ngă(n c)ătrongăkhiăchi uădƠiăláăkhôngăb ă nhă h ng.ăCơyăm ăćăs ăláăcaoănh tă ănghi măth căOCă+ăNaClălƠănghi măth c cơyăđ că x ălỦăv iăoligochitosanătrongăđi uăki năm n.ăCơyăm ăkhiăđ căx ălỦăv iăoligochitosană (nghi măth căOCăvƠăOCă+ăNaCl)ăćăs l ngăr ăcaoăh năsoăv iăkhiăcơyăb ăm n,ăt ngă đ ng v iăđ iăch ngăkhôngăm n.ăVi căx ălỦăcơyăm ălúaătrongăđi uăki năm năv iă oligochitosanăc ngăc iăthi năđ căchi uăr ngălá. S ăb ăsungăoligochiotsanăđưălƠmă t ngăđángăk ăchi uădƠiăthơnălúa.
B ng 3.1: Hình thái cây m lúa x lý cácăđi u ki n khác nhau
Nghi m th c
Chi u cao cây
(cm) S lá Chi u dài lá (cm) Chi u r ng lá (cm) S r H2O 7,51 ± 1,94 b 1,17 ± 0,38bc 4,04 ± 0,77a 0,30 ± 0,00a 7,23 ± 1,09b NaCl 7,28 ± 1,27 b 1,07 ± 0,25c 3,89 ± 0,64a 0,26 ± 0,04b 6,35 ±