2.4.3.1. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sau lây nhiễm trên tế bào
Tiến hành lây nhiễm NPV vào dịch tế bào sâu khoang nuôi nhân trên môi trường Excell 420- 14419C bổ sung 15% FBS theo chỉ số MOI là 0,1 ở nhiệt độ 28 ± 0,50C và pH môi trường nuôi nhân là 7,0 trong thời gian 3 ngày trên các bình cổ vếch nắp lọc khuẩn loại 250m2 theo phương pháp lắc 50 vịng/phút liên tục 24 giờ. Sau đó, thu hoạch dịch thể virus để thực hiện thí nghiệm tinh sạch thể vùi NPV dựa theo phương pháp của các tác giả Shapiro và Shepard (2007), Kanokwan et al. (2003) và Sajap et al. (2000) [90, 79, 14].
Thể vùi NPV sâu khoang sau lây nhiễm được tinh sạch bằng cách ly tâm loại bỏ dịch lây nhiễm được tiến hành qua thí nghiệm với 7 cơng thức, mỗi công thức thực hiện với lượng 100ml dịch chứa thể vùi. Cụ thể các công thức như sau:
Công thức 1: Ly tâm 2 lần bằng nước cất Công thức 2: Ly tâm 3 lần bằng nước cất Công thức 3: Ly tâm 4 lần bằng nước cất
Công thức 4: Ly tâm 2 lần, gồm 1 lần nước cất và 1 lần bằng dung dịch SDS Công thức 5: Ly tâm 3 lần theo thứ tự: nước cất- SDS- nước cất
Công thức 6: Ly tâm 4 lần theo thứ tự: SDS- nước cất- SDS- nước cất
Công thức 7: Ly tâm 5 lần, gồm 3 lần nước cất và 2 lần bằng dung dịch SDS theo thứ tự các bước: nước cất- SDS- nước cất- SDS- nước cất
62
Trước và sau khi ly tâm, tiến hành lấy mẫu xác định hàm lượng thể vùi theo phương pháp nhuộm Trypan blue trên buồng đếm hồng cầu Neubauer dưới kính hiển vi ở mỗi lần nhắc lại của các cơng thức thí nghiệm.
Đồng thời, thể vùi được cho vào các lọ bảo quản loại 10ml có chứa 1ml DMSO lắc đều và bảo quản lâu dài ở điều kiện nhiệt độ 5- 100C hoặc ở điều kiện phịng thí nghiệm khơng bị ánh nắng hoặc tia tử ngoại chiếu vào trước khi sử dụng để tạo dạng chế phẩm.
2.4.3.2. Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước
Việc phát triển chế phẩm dạng bột thấm nước được tiến hành dựa theo phương pháp của Shapiro et al. (2008) và Cisneros et al. (2002) [90, 94]. Thành
phần phụ gia để tạo dạng bột thấm nước gồm 60% bột tan và 40% bột khoáng sét. Các phụ gia được nghiền nhỏ mịn với kích thước 0,02- 0,05mm.
Trước hết, đếm số lượng thể vùi tinh và tính tốn số lượng thể vùi cần thiết trong chế phẩm dự kiến tạo dạng, để có thể sử dụng với liều lượng 500 gam/ha cần có số lượng thể vùi trong chế phẩm là 2 x 109 OB/gam, để sau khi phối trộn đảm bảo lượng thể vùi sẽ phun rải cho 1 ha cây trồng là 1 x 1012 OB/ha như chỉ dẫn của Cisnaros et al. (2002) [4] và Lynn (2002) [30]. Việc phối trộn để tạo chế phẩm bột thấm nước được thực hiện trên máy xay sinh tố trong thời gian 5 phút.
Sau 3 phút đầu của quá trình phối trộn, tiến hành kiểm tra và điều chỉnh đảm bảo mức pH từ 6,5- 7,0 bằng KOH 0,1%. Sau đó, tiếp tục đảo trộn trong thời gian 2 phút rồi đưa vào sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 30- 350C trong thời gian 10- 12 giờ để độ ẩm ở mức 10- 12%. Đóng gói trong bao giấy bạc và bảo quản chế phẩm ở nhiệt độ thường hoặc nhiệt độ từ 5 đến 100C. Chế phẩm sử dụng cho thí nghiệm trong phịng và ngồi nhà lưới đã qua bảo quản 28 ngày và thí nghiệm ngồi đồng ruộng đã qua bảo quản 30 ngày ở điều kiện bình thường.
2.4.3.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được
• Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang trong điều kiện
phịng thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí trong phịng thí nghiệm theo phương pháp Nghiên cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (2000) [109] tại Trung tâm Đấu tranh
63
Sinh học. Tiến hành theo phương pháp nhúng lá vào dịch thuốc đã pha cho từng loại thuốc, để ráo rồi thả sâu. Thực hiện với 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại với 50 sâu khoang tuổi 2, gồm các công thức (CT) sau:
CT 1: Chế phẩm NPV-1 chứa 2.109 OB/gam WP, nồng độ phun 0,1%
CT 2: Chế phẩm NPV-2 chứa 2.109 OB/gam WP (có 0,5% Boric), nồng độ phun 0,1%
CT 3: Sâu chết bệnh nghiền lọc, liều lượng 500 sâu/ha, nồng độ phun 5% CT 4: Đối chứng nhúng nước lã
Theo dõi số sâu sống, sâu chết sau 7 ngày phun và tính hiệu lực gây chết sâu khoang theo công thức Abbot (1925):
C – T
H(%) = ------------ x 100 C
Trong đó: H (%): Tỷ lệ sâu chết
C: Số sâu sống ở cơng thức đối chứng sau thí nghiệm T là số sâu sống ở cơng thức đối chứng sau thí nghiệm
• Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phịng trừ sâu khoang ngồi nhà lưới
Thí nghiệm tiến hành ngoài nhà lưới trong năm 2018 theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 12561:2018 về Khảo nghiệm hiệu lực của thuốc bảo vệ thực vật của Bộ Nông nghiệp và PTNT [110], với 4 công thức (CT), mỗi công thức nhắc lại 3 lần. Mỗi lần nhắc lại tiến hành trên 10 cây bắp cải 50 ngày tuổi được thả 5 sâu tuổi 2 cho mỗi cây. Sau 1 ngày để sâu phân bố ổn định trên cây thì tiến hành phun chế phẩm 120ml/lần nhắc lại nước thuốc pha theo tỷ lệ cho mỗi cơng thức thí nghiệm. CT1: Phun NPV-1 (khơng có Boric), liều lượng 500 gam/ha, nồng độ phun 0,1% CT2: Phun NPV-2 (có 0,5% Boric), liều lượng 500 gam/ha, nồng độ phun 0,1% CT3: Sâu chết bệnh nghiền, lọc với liều lượng 500 sâu/ha và nồng độ phun 5% CT4: Đối chứng, phun nước lã
Theo dõi số sâu khoang sống trên 3 cây ngẫu nhiên của một lần nhắc lại vào thời điểm trước phun và sau phun 7 ngày. Tính hiệu lực phịng trừ sâu khoang của chế phẩm theo công thức Henderson – Tilton (1955):
64
H (%) = (1 - ----------- ) x 100 Tb x Ca
Trong đó: H (%): Hiệu lực trừ sâu
Ta là số sâu sống ở cơng thức thí nghiệm sau xử lý Tb là số sâu sống ở cơng thức thí nghiệm trước xử lý Ca là số sâu sống ở công thức đối chứng sau xử lý Cb là số sâu sống ở cơng thức đối chứng trước xử lý
• Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phịng trừ sâu khoang ngồi đồng ruộng
+ Đánh giá hiệu lực phịng trừ sâu khoang trên bắp cải
- Đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên bắp cải
Việc đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm trên bắp cải được tiến hành theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 12561:2018 về Khảo nghiệm hiệu lực của thuốc bảo vệ thực vật của Bộ Nông nghiệp và PTNT [110]. Thí nghiệm tiến hành tại Vân Nội (Đông Anh- Hà Nội) khi sâu phát sinh rộ ở tuổi 2. Bố trí thí nghiệm theo khối ngẫu nhiên với 4 cơng thức, nhắc lại 3 lần, diện tích bắp cải sử dụng cho mỗi lần nhắc lại là 50m2 với lượng 3 lít nước thuốc đã pha phun cho mỗi lần nhắc lại theo tỷ lệ cho từng cơng thức thí nghiệm.
CT1: Sử dụng NPV1 (khơng bổ sung Boric) với liều lượng 500 gam/ha CT2: Sử dụng NPV2 (có bổ sung 0,5% Boric) với liều lượng 500 gam/ha CT3 (đối chứng 1): Sâu nghiền, lọc với lượng 500 sâu/ha, nồng độ phun 5% CT4 (đối chứng 2): Phun nước lã
Theo dõi theo phương pháp 5 điểm chéo góc, tại mỗi ơ nhắc lại theo dõi số sâu khoang sống trên diện tích 1m2 bắp cải vào thời điểm trước phun, sau phun 5; 7 và 10 ngày. Tính hiệu lực phịng trừ sâu theo cơng thức Henderson- Tilton (1955).
- Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang với các liều lượng sử dụng chế
phẩm NPV-1 WP khác nhau trên bắp cải
Thí nghiệm tiến hành tại Vân Nội (Đơng Anh- Hà Nội) trong vụ Đông Xuân năm 2018 nhằm xác định liều lượng thích hợp khi sử dụng chế phẩm để phịng trừ sâu khoang trên bắp cải theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 12561:2018 về Khảo nghiệm hiệu lực của thuốc bảo vệ thực vật của Bộ Nông nghiệp và PTNT [110].
65
Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên với 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần với diện tích mỗi ơ thí nghiệm là 100 m2. Điều tra theo dõi khi sâu phát sinh rộ ở tuổi 2 thì tiến hành phun với lượng 6 lít nước thuốc đã pha cho mỗi lần nhắc lại theo tỷ lệ thuốc pha cho từng cơng thức thí nghiệm.
Cơng thức 1: Liều lượng 400g/ha Công thức 2: Liều lượng 500g/ha Công thức 3: Liều lượng 600g/ha
Công thức 4: Phun thuốc Aba Fax 3.6EC chứa hoạt chất Abamectin với liều lượng 200 gam/ha theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
Công thức 5: Đối chứng không phun.
Theo dõi số sâu khoang sống trong mỗi ô nhắc lại theo phương pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm tiến hành điều tra 1m2 vào các thời điểm trước phun, sau phun 5; 7 và 10 ngày. Tính hiệu lực phòng trừ sâu của chế phẩm theo công thức Henderson- Tilton (1955).
+ Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên đậu tương
- Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP với các liều lượng sử dụng khác nhau trên đậu tương
Thí nghiệm trên đậu tương được tiến hành tại Mỹ Thành (Mỹ Đức- Hà Nội) trong vụ Xuân Hè năm 2018 nhằm xác định liều lượng thích hợp khi sử dụng chế phẩm để phòng trừ sâu khoang trên đậu tương. Thí nghiệm tiến hành theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 12561:2018 về Khảo nghiệm hiệu lực của thuốc bảo vệ thực vật của Bộ Nông nghiệp và PTNT [110]. Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên với 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần. Điều tra theo dõi khi sâu phát sinh rộ ở tuổi 2 vào giai đoạn cây chuẩn bị ra hoa thì tiến hành phun 6 lít nước thuốc đã pha cho mỗi ơ thí nghiệm với diện tích 100 m2.
Cơng thức 1: Liều lượng 400g/ha Công thức 2: Liều lượng 500g/ha Công thức 3: Liều lượng 600g/ha
Công thức 4: Phun thuốc Aba Fax 3.6EC chứa hoạt chất Abamectin với liều lượng 200 gam/ha theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
66 Công thức 5: Đối chứng không phun.
Theo dõi số sâu sống trên đậu tương theo phương pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 1m2 của mỗi ô nhắc lại vào thời điểm trước và sau phun 5; 7 và 10 ngày. Tính hiệu lực phịng trừ sâu của chế phẩm theo cơng thức Henderson – Tilton.
- Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên đậu tương
Tiến hành theo phương pháp của Viện Bảo vệ thực vật (2000) [109] và Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 12561:2018 về Khảo nghiệm hiệu lực của thuốc bảo vệ thực vật của Bộ Nông nghiệp và PTNT [110]. Thí nghiệm diện rộng khơng nhắc lại, trên đậu tương khi sâu non sâu khoang tuổi 2 phát sinh rộ vào giai đoạn cây chuẩn bị ra hoa. tại Mỹ Thành (Mỹ Đức- Hà Nội) trong vụ Xuân Hè năm 2018 với 2 cơng thức diện tích của mỗi công thức là 1ha. Cụ thể:
- Công thức 1: Phun NPV-1 với lượng 500 gam/ha và nồng độ phun 0,1%. - Công thức 2: Đối chứng, phun thuốc hoá học Aba Fax 3.6EC với lượng
phun 200 gam/ha
Theo dõi số sâu khoang tương tự như với thí nghiệm trên bắp cải nêu trên, bằng cách điều tra số sâu khoang sống theo phương pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 1m2 vào các thời điểm: trước phun và sau phun 5, 7, 10 ngày. Tính hiệu lực phịng trừ sâu khoang theo cơng thức Henderson – Tilton (1955).