2.3.1. Phương pháp lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn 2.3.1.1. Phương pháp định lượng sinh khối vi sinh vật 2.3.1.1. Phương pháp định lượng sinh khối vi sinh vật
Hàm lượng sinh khối của vi sinh vật được xác định theo phương pháp của Mira de Orduna [101].
Tiến hành: 10ml môi trường chứa vi sinh vật được ly tâm thu sinh khối tại điều kiện 5000 rpm/min/10 phút. Sinh khối thu được được rửa bằng nước cất với thể tích dịch 10ml/2 lần. Sinh khối sau đó được sấy đến trọng lượng không đổi tại 1050C. Trọng lượng sinh khối vi sinh vật (g sinh khối khơ/l) được tính qua sự chênh lệch khối lượng của cốc đựng trước và sau khi sấy.
2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng canthaxanthin
Hàm lượng canthaxanthin tổng số được xác định theo phương pháp của Dan Qiu [102].
250ml chloroform, đưa vào máy ly tâm, thu được dịch trích ly sơ bộ (dung dịch A). Lấy 5ml dung dịch A cô quay chân không ở 550C/150mmHg, thu cặn, hòa tan cặn bằng: 0.5ml ethanol, 0.5ml chloroform và 99ml cyclohexane thu dung dịch phân tích (dung dịch B) (xem hình 2.3.1)
Hình 2.3.1. Quy trình xử lý mẫu xác định hàm lượng canthaxanthin
Dung dịch B (Dung dịch phân tích)
100 mg mẫu
Đun 600C, trong 5 phút 10ml nước
100ml EtOH Ly tâm chloroform 250ml
Dung dịch A (5ml)
Cô quay chân không (550C; 150mmHg) Dịch cô 99ml cyclohexane 0.5ml etanol 0.5ml chloroform Hịa tan
- Quy trình phân tích canthaxanthin: khởi động thiết bị đo UV, chỉnh bước sóng đến =470nm, sử dụng mẫu blank là cyclohexane. Đo dịch phân tích B tại bước sóng 470nm. Hàm lượng canthaxanthin trong dịch mẫu được xác định theo cơng thức:
= Trong đó:
A: độ hấp phụ của dung dịch mẫu tại bước sóng 470nm 5000: hệ số pha loãng
A(1%): độ hấp phụ của dung dịch canthaxanthin 1% pha trong cyclohexane xác định bằng thực nghiệm, A= 2100
M: trọng lượng mẫu phân tích
2.3.1.3. Phương pháp xác định sản lượng canthanxanthin
Sản lượng canthaxanthin được xác định theo cơng thức: =
Trong đó:
msk: hàm lượng sinh khối vi sinh vật (g sinh khối khô/l) Cx (g/g): hàm lượng canthaxanthin vi sinh vật
SCX ((g/l): sản lượng canthaxanthin vi sinh vật
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men 2.3.2.1. Xác định hàm lượng tổng carotenoid 2.3.2.1. Xác định hàm lượng tổng carotenoid
Để xác định hàm lượng tổng carotenoids, lấy 15 gam mẫu đem chiết với 25ml acetone sau đó tiến hành lọc chân khơng ba lần, q trình chiết được thực hiện 3 lần đến khi dịch chiết nhạt màu. Dịch chiết này sau đó được chuyển đến bình chiết phân bố dung tích 500 ml có chứa 40 ml ete dầu hỏa. Acetone được loại bỏ bằng cách bổ sung chậm nước tinh khiết để ngăn chặn sự hình thành nhũ tương. Các thành phần carotenoid sẽ chuyển sang pha ete dầu hỏa, pha nước hòa tan acetone được loại bỏ dần. Quá trình lặp được thực hiện lặp lại bốn lần cho tới khi khơng cịn acetone. Pha ete dầu hỏa chứa carotenoid được chuyển sang bình 50 ml có chứa natri sulfat khan để loại bỏ hoàn toàn nước. Dịch ete dầu hỏa chứa carotenoid được so quang ở bước sóng 450 nm. Lượng carotenoid tổng được tính theo cơng thức:
Trong đó: A: độ hấp thụ
V: tổng thể tích mẫu P: khối lượng mẫu
: β-carotene Extinction Coefficient trong ete dầu hỏa ( : =2592)
2.3.2.2. Xác định hàm lượng canthaxanthin bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Mẫu được chiết tách bằng phương pháp chiết siêu âm (chiết có hỗ trợ của sóng siêu âm) với hệ dung môi là chloroform-methanol (2:1; v/v), hiệu suất chiết đạt khoảng 95%. Cô đặc dịch chiết và tiến hành đông khô mẫu thu được cao chiết tổng. Hàm lượng canthaxanthin trong cao tổng được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Điều kiện chạy máy gồm: pha động là hệ dung môi axetonitril: methanol (95:5; v/v), Cột phân tích C18 (4.6mm x 250mm, cỡ hạt 5µm), Detector PDA hoặc UV-Vis, bước sóng 475nm. Trong đó thể tích bơm mẫu 20 µl, tốc độ dịng 1ml/phút, nhiệt độ buồng chạy mẫu: 300C.
Từ chất chuẩn canthaxanthin, sử dụng phương pháp HPLC tiến hành xây dựng đồ thị đường chuẩn thể hiện tương quan giữa hàm lượng canthaxanthin và diện tích peak. Dựa vào đồ thị đường chuẩn sẽ xác định được hàm lượng canthaxanthin trong các mẫu thử.
2.3.2.3. Phương pháp sắc kí lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715) và RP-18 F254s (Merck).
Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở 2 bước sóng 254nm và 365nm. Sử dụng là dung dịch H2SO4 5% phun lên bản mỏng và hơ nóng trên bếp điện đến khi hiện màu các hợp chất, một số thuôc thử khác như dung dịch vanilin/ H2SO4 (1%), dung dịch Fe3+/H2SO4 (1%), thymol/ H2SO4 (0,5%).
2.3.2.4. Phương pháp sắc kí cột
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo. Silicagel pha thường có cỡ hạt 0.04 0.063 mm (240 ÷ 430 mesh). Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30 50µm). Selphadex LH-20 (Merck).