2.3.3.2. Đánh giá tổng lượng sinh khối biofilm
Tổng lượng sinh khối biofilm sẽ được đánh giá thông qua việc nhuộm và đo hấp thụ với tím tinh thể (crystal violet - CV).
Tương tự như trường hợp định lượng VSV sống, mẫu biofilm sẽ được rửa nhẹ với 2 lần PBS, loại lượng PBS cịn sót với giấy thấm. Biofilm sau đó sẽ được sấy khơ để cố định ở 60℃ trong tối thiểu 2 giờ. Mẫu sau đó sẽ được nhuộm với tím tinh thể (nồng độ 50 mg/l) trong vòng 15 phút, nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Các mẫu biofilm sau đó sẽ được loại CV dư và rửa nhẹ nhàng với nước RO. CV sẽ được hòa tan trong acid acetic 66% trong vòng 1 tiếng, tránh ánh sáng. Các đĩa mẫu sẽ được đi đo hấp thụ UV tại bước sóng 570nm trên máy đọc vi đĩa Varioskan Lux.
2.3.4. Phương pháp chuẩn bị các mẫu thử
Các mẫu cao dược liệu được chuẩn bị trong DMSO với nồng độ 10000 mg/l. Trường hợp mẫu không tan trong DMSO, tan trong môi trường ni cấy, thực hiện hịa tan trong môi trường nuôi cấy TSB-glucose-NaCl (TGN). Loại bỏ các mẫu không tan trong cả DMSO lẫn TGN. Sau khi hịa tan, mẫu dược liệu sẽ được pha lỗng tiếp trong TGN để đạt được nồng độ 1000 mg/l. Dung dịch này sẽ được pha loãng 10 lần trong TGN (hoặc moxifloxacin nồng độ 1,5 mg/l trong TGN, hoặc vancomycin nồng độ 20 mg/l) để đạt được dung dịch làm việc 100 mg/l. Một thực nghiệm trước đó của chúng tơi đã chỉ ra nồng độ DMSO 1% khơng có ảnh hưởng đến S. aureus ở dạng tự do cũng như trong biofilm.
2.3.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng biofilm của một số dược liệu
Biofilm 24 giờ của S. aureus trong TGN được sử dụng để đánh giá hoạt tính của cao dược liệu trên biofilm. Thực hiện với 3 điều kiện là ở dạng đơn, kết hợp moxifloxacin (Mxf) nồng độ 1,5mg/l và kết hợp với vancomycin (Van) nồng độ 20mg/l. Cao dược liệu được sử dụng với nồng độ 100mg/l. Sau khi loại bỏ môi trường nuôi cấy,
20
thêm môi trường TGN, TGN-Mxf, TGN-Van cho mẫu chứng; ba môi trường tương tự sẽ được kết hợp với cao dược liệu nồng độ 100 mg/l để làm mẫu thử. (xem hình mơ tả thí nghiệm ở hình 2.2)