CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
3.3. Phân lập hợp chất trong phân đoạn ethylacetat
Từ cắn chiết EtOAc (15g) được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là Sephadex LH20. Cắn EtOAc được hòa tan trong một lượng dung mơi tối thiểu. Cột sắc ký có đường kính 2,5 cm được làm sạch khơ cố định thẳng đứng trên giá và lót một lớp bơng dưới đáy cột. Rửa giải với hệ dung môi EtOH- H2O (1:1) thu được 4 phân đoạn AC1- AC4.
Phân đoạn AC1 (900mg) được tiếp tục phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thường với dung môi rửa giải là CH2Cl2: MeOH: H2O (5:1:0,1) thu được 6 phân đoạn nhỏ từ AC1.1- AC1.6. Từ phân đoạn AC 1.1 (100mg) tinh chế qua cột sắc ký hấp phụ silica gel pha thường, dung môi rửa giải CH2Cl2:CH3OH(1:10), thu được hợp chất AC-T1 (59mg).
Phân đoạn AC3 (1.5g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường với dung môi rửa giải là CH2Cl2: MeOH: H2O (3:1:0,1) thu được 5 phân đoạn nhỏ AC3.1- AC3.5. Từ phân đoạn AC3.3 (400mg) tinh chế tiếp bằng chất hấp phụ silica gel pha thường, dung môi rửa giải EtOAc:Aceton(1:1,5) thu được hợp chất AC-T2(40mg). Quá trình phân lập hợp chất AC-T1 và AC-T2 được biểu diễn theo sơ đồ sau:
24 AC 1 AC 2 AC 3 AC 4 AC 1.1 … AC 1.3 AC 3.1 AC 3.3 AC 3.5 AC- T2 (40mg) - Sephadex LH2 - Ethanol: H2O: 1:1 Silicagel CH2Cl2: MeOH: H2O (3:1:0,1) Silicagel EtOAc:Aceton (1:1,5) AC- T1 (59mg) Silicagel CH2Cl2: CH3OH (10:1) Cắn ethyl acetat(15g) … Silicagel CH2Cl2:MeOH:H2O (5:1:0,1)
25
3.4 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập 3.4.1 Hợp chất AC-T1
Hợp chất AC-T1 là chất rắn vơ định hình màu vàng nhạt.
Trên phổ 1H-NMR của hợp chất AC-T1 thu được 4 tín hiệu hấp thụ của proton thơm ở vùng trường thấp, trong đó có một tín hiệu singlet tại δH 7,03 (1H, s, H-8) chứng tỏ các carbon liên kết xung quanh nguyên tử carbon này là các carbon bậc 4. Phân tích hằng số tương tác của 3 proton thơm còn lại trên phổ cho thấy sự có mặt của hệ tương tác spin ABX tại δH 7,73 (1H, d, J = 8.5Hz, H-2’), 7,09 (1H, d, J = 2,0Hz, H-5’) và 7,76 (1H, dd, J = 8,5; 2,0Hz, H-6’), chứng tỏ có sự xuất hiện của một vịng benzene thế ở vị trí 1, 3, 4. Sự có mặt của 6 nhóm methoxy cũng đã được ghi nhận với 6 tín hiệu singlet của các proton trong nhóm tại δH 3,89 (3H, s, 3-OCH3), 3,96 (3H, s, 5-OCH3), 3,80 (3H, s, 6-OCH3), 4,01 (3H, s, 7-OCH3) và 3,93 (6H, s, 3’, 4’- OCH3). (Xem hình 5 và bảng 5).
Hình 5: Phổ giãn 1H-NMR của AC-T1
Trên phổ 13C-NMR, phát hiện các tín hiệu cacbon có δC theo thứ tự là: 175,6; 159,7; 155,5; 155,1; 153,2; 152,9; 150,3; 141,8; 141,5; 124,2; 123,3; 113,5; 112,8; 112,5; 97,7; 62,6; 61,8; 60,3; 57,0; 56,7; 56,4 ppm. Trong đó có 15 cacbon có tín hiệu đặc trưng cho cấu trúc của khung flavonoid tại δC 155,2 (C-2); 141,5 (C-3); 175,6 (C-4); 153,2 (C-5); 141,8
26
(C-6); 159,7 (C-7); 97,7 (C-8); 155,5 (C-9); 113,5 (C-10); 124,2 (C-1΄); 112,8 (C-2΄); 152,9 (C-3΄); 150,3 (C-4΄); 112,5 (C-5΄); 123,3 (C-6΄). Trên phổ 13C-NMR cịn phát hiện được tín hiệu của các nhóm methoxy (OCH3) tại δC 61,8 (3-OCH3), 62,6 (5-OCH3), 60,3 (6-OCH3); 57,0 (7-OCH3); 56,4 (3′-OCH3); 56,7 (4′-OCH3). (Xem hình 6và bảng 5).
Hình 6: Phổ giãn 13C-NMR của hợp chất AC-T1
Vị trí của các nhóm methoxy tại C-3, 5, 6, 7, 3′ và 4′ được khẳng định qua phân tích phổ 2 chiều HMBC với các tương tác chính tại δH 3,89 với C-3 (δC 141,5), 3,96 với C-5 (δC 153,2), 3,80 với C-6 (δC 141,8), 4,01 với C-7 (δC 159,7), 3,93 với C-3′ (δC 152,9) và C-4′ (δC 150,3). (Xem hình 7 và bảng 5).
Từ các phân tích dữ liệu phổ thu được và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất AC-T2 có tên là 3,3',4',5,6,7–hexamethoxyflavone [17, 28].
27
Hình 7: Phổ HMBC của hợp chất AC-T1
Bảng 5: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương tác HMBC của hợp chất AC-T1 Vị trí 𝛿𝐻𝑎,𝑏(ppm), (độ bội, J(Hz)) 𝛿𝐶𝑎,𝑐, ppm Tương tác HMBC (H→C) 2 - 155,2 3 - 141,5 4 - 175,6 5 - 153,2 6 - 141,8 7 - 159,7 8 7,03 (s) 97,7 C-6, 7, 9, 10, 4 9 - 155,5 10 - 113,5 1’ - 124,2 2’ 7,73 (d, J = 8.5Hz) 112,8 C-4′, 6′ 3’ - 152,9 4’ - 150,3
28 5’ 7,09 (d, J = 2,0Hz) 112,5 C-1′, 3′ 6’ 7,76 (dd, J = 8,5; 2,0Hz) 123,3 C-2′, 5′ 3-OCH3 3,89 (s) 61.8 C-3 5- OCH3 3,96 (s) 62,6 C-5 6- OCH3 3,80 (s) 60,3 C-6 7- OCH3 4,01 (s) 57,0 C-7 3’-OCH3 3,93 (s) 56,4 C-3′ 4’-OCH3 3,93 (s) 56,7 C-4′
a: đo trong MeOD, b: 500MHz, c: 125MHz
Hình 8: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của AC-T1
3.3.2 Hợp chất AC- T2
Hợp chất AC-T2 là chất rắn vơ định hình màu vàng
Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 2 hệ tương tác spin A2B2 của vòng benzene tại δH [6,92 (2H; br s; H-2; H-6), 6,65 (2H; d; J=7,2Hz; H-3; H-5), 7,40 (2H; d; J=8,4Hz; H-2΄΄΄΄; H-6΄΄΄΄)’ 6,84 (2H; d; J=8,4Hz; H-3΄΄΄΄; H-5΄΄΄΄)]; một tín hiệu singlet của proton thơm tại δH 6,19 (1H; s; H-5΄). Ngoài ra, phát hiện 2 proton olefine tại δH 7,48 (1H; d;
J=16,2 Hz; H-7΄΄΄΄); 6,1 (1H; d; J=16,2 Hz; H-8΄΄΄΄) với giá trị J=16,2 Hz chứng tỏ liên kết
đơi có cấu hình trans. Sự xuất hiện của 3 proton anomeric tại δH 3,97 (H-F1); 5,09 (H-1΄΄); 5,76 (1H; s; H-A1) và các tín hiệu của proton carbinol tại δH nằm trong khoảng 2,91-5,53 ppm và 2 tín hiệu của 2 nhóm CH3 tại δH 1,35 (3H; br s; H-6΄΄); 0,85 (3H; br s; H-F6) từ đó gợi ý cho sự tồn tại của 3 phân tử đường bao gồm 1 gốc α-arabinofuranosyl và 2 gốc β- fucosyl trong cấu trúc của phân tử AC-T2. (Xem hình 9, 10 và bảng 6).
29
Hình 9: Phổ giãn 1H-NMR ở vùng trường thấp của hợp chất AC-T2
30
Trên phổ 13C-NMR phát hiện các tín hiệu C tại δ: 206,2; 167,5; 165,0; 161,2; 156,6; 146,3; 133,97; 131,2; 130,4; 127,2; 116,9; 116,3; 115,3; 107,1; 105,7; 105,5; 96,0; 93,0; 92,8; 84,48; 76,8; 76,3; 74,8; 73,5; 72,98; 72,76; 72,2; 71,8; 62,0; 47,5; 30,3; 17,2; 16,9.(xem hình và bảng). Kết hợp với phân tích phổ 2 chiều HSQC, HMBC cho thấy sự có mặt của aglycon phloretin thơng qua các tương tác được thể hiện trên phổ HMBC như của proton H-8 (2H, δH 3,38; 3,10) với cacbon C-1 (δC 134,0); cacbon C-9 (δC 206,2) và C-1΄ (δC 105,7); proton H-7 (2H, δH 2,77; 1,34) với cacbon C-9 (δC 206,2), C-8 (δC 47,5), C-1 (δC 134,0), C-2 (δC 130,4), C-6 (δC 130,4); proton H-2 (δH 6,92) và proton H-6 (δH 6,92) với cacbon C-4 (δC 156,6); proton H-3 (δH 6,65) và proton H-5 (δH 6,65) với cacbon C-1 (δC 134,0). (Xem hình 11 và bảng 6).
Hình 11: Phổ giãn 13C-NMR của hợp chất AC-T2
Trên phổ tương tác hai chiều HMBC phát hiện được sự có mặt của mạch p- coumaroyl thông qua các tương tác như của proton H-7΄΄΄΄ (δH 7,48) và proton H-8΄΄΄΄ (δH 6,1) với cacbon C-9΄΄΄΄ (δC 167,5); proton H-8΄΄΄΄ (δH 6,1) với cacbon C-1΄΄΄΄ (δC 127,2); proton H7΄΄΄΄ (δH 7,48) với cacbon C-2΄΄΄΄ (δC 131,2) và cacbon C-6΄΄΄΄ (δC 131,2); tương tác đặc trưng của vòng benzene như của cacbon có δC 6,84 (C-3΄΄΄΄, C-5΄΄΄΄) với cacbon có δC 127,2 (C-1΄΄΄΄); tương tác của cacbon có δC 131,2 (C-2΄΄΄΄, C-6΄΄΄΄) với cacbon C-4΄΄΄΄ (δC 161,2).
31
Hình 12: Phổ HMBC của hợp chất AC-T2
Vị trí của 3 gốc đường cũng được thể hiện rõ rang thơng qua phân tích tín hiệu từ phổ 2 chiều HMBC. Một gốc đường β-fucosyl (A) liên kết với phần aglycon phloretin qua liên kết C-glycosid tại vị trí C-3΄thể hiện qua tương tác của H-1΄΄ (δH 5,09,d) với cacbon C-3΄ (δC 105,7), cacbon C-2΄ (δC 165,0), cacbon C-4΄ (δC 165,0). Đồng thời mạch p-coumaryl được phát hiện là liên két với phân tử đường A tại vị trí C-2΄΄ dựa vào tương tác trên phổ HMBC của H-2΄΄ (δH 5,53, br s) với cacbon C-9΄΄΄΄ (δC 167,5). Gốc đường α- arabinofuranosyl cũng liên kết với aglycon phloretin thơng qua liên kết ether tại vị trí C-6΄ với tương tác của H-A1 (δH 5,76 s) với C-6΄ (δC 161,7). Gốc đường β-fucosyl(B) còn lại được xác định liên kết với phân tử đường α-arabinofuranosyl tại vị trí C-A2 thông qua tương tác trên phổ HMBC của H-A2 (δH 4,19 br s) với C-F1 (δC 105,5) và tương tác của H-F1 (δH 3,97 d) với C-A2 (δC 92,8). (Xem hình 12 và bảng 6).
Từ các phân tích dữ liệu phổ thu được và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất AC-T2 có tên là phloretin 3′-C-[(2-O-trans-p-coumaroyl)- β-D-fucopyranosyl]-6′-O-β-D- fucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabifuranoside [16].
32
Bảng 6: Dữ liệu 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất AC-T2
Vị trí 𝛿𝐻𝑎,𝑏 (ppm), (độ bội, J(Hz)) 𝛿𝐶𝑎,𝑐, ppm Carambolaside Q [16] 1 - 134,0 134,0 2 6,92 (br s) 130,4 130,4 3 6,65 (d, J=7,2 Hz) 116,3 116,3 4 - 156,6 156,5 5 6,65 (d, J=7,2 Hz) 116,3 116,3 6 6,92 (br s) 130,4 130,4 7 2,77 * 1,34 * 30,3 30,3 8 3,38 * 3,10 * 47,5 47,5 9 - 206,2 206,2 1’ - 105,7 105,5 2’ - 165,0 165,1 3’ - 105,7 105,6 4’ - 165,0 165,1 5’ 6,19 (s) 96,0 96,2 6’ - 161,5 161,6 1” 5,09 * 73,9 73,9 2” 5,53 (br s) 73,0 73,0 3” 3,85 * 74,5 74,6 4” 3,80 * 73,3 73,5 5” 3,85 * 76,8 76,3 6” 1,35 (br s) 17,2 17,1 1”” - 127,2 127,2 2”” 7,40 (d; J=8,4Hz) 131,2 131,2 3”” 6,84 (d; J=8,4Hz) 116,9 116,9 4”” - 161,2 161,2 5”” 6,84 (d; J=8,4Hz) 116,9 116,9
33 6”” 7,40 (d; J=8,4Hz) 131,2 131,2 7”” 7,48 (d; J=16,2Hz) 146,3 146,3 8”” 6,10 (d; J=16,2Hz) 115,3 115,3 9”” - 167,5 168,3 A1 5,76 (s) 107,1 107,1 A2 4,19 (br s) 92,8 92,9 A3 4,12 m 76,3 76,8 A4 3,97 * 84,5 84,5 A5 3,80 * 62,0 62,0 3,65 * F1 3,97 * 105,5 105,7 F2 3,4 * 72,2 72,2 F3 3,25 * 74,8 74,8 F4 3,4 * 72,8 72,8 F5 2,91 * 71,8 71,7 F6 0,85 (br s) 16,9 16,9 *: tín hiệu chập pick
34
35
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1 Về kết quả định tính các hợp chất hữu cơ có trong dược liệu.
Qua kết quả định tính có thể thấy được trong cây khế chua có chứa các thành phần: flavonoid, saponin, tannin, đường khử, sterol, … kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về các thành phần hóa học trong Averrhoa carambola. Qua các phản ứng định tính flavonoid, nhận thấy các phản ứng cho kết quả dương tính rõ ràng nên có thể sơ bộ tổng kết được rằng trong cây khế chua có chứa một lượng lớn các hợp chất flavonoid, nhóm chất này là nhóm chất có rất nhiều tác dụng sinh học như chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan, …. Hàm lượng flavonoid có thể giải thích được một số tác dụng sinh học mà dịch chiết lá Averrhoa carambola thể hiện ra nhưng để xác định chính xác thành phần nào đưa tới tác dụng nào thì cần nghiên cứu bổ sung.
4.2 Về kết quả chiết xuất
Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết lạnh bằng EtOH 96%. Phương pháp chiết này đơn giản, dễ thực hiện. Dung môi EtOH là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, tương đối thân thiện với mơt trường đồng thời có thể chiết xuất được nhiều hoạt chất trong dược liệu. Cao tổng thu được tiếp tục được chiết phân bố thành các phân đoạn với các dung mơi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dichloromethan, ethyl acetat để thu được các cao phân đoạn tương ứng.
Q trình phân lập các chất hóa học sử dụng phương pháp sắc ký cột, phương pháp này dễ thực hiện, chi phí thấp và phù hợp với quy mơ phịng thí nghiệm. Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để lựa chọn phân đoạn, khảo sát hệ dung mơi rửa giải, định tính các chất trong phân đoạn và theo dõi các chất trong quá trình phân lập.
4.3 Về kết quả phân lập
Trong quá trình thực hiện nghiên cứu, bằng vào kỹ thuật sắc ký cột với chất nhồi cột silica gel pha thuận, shephadex LH20 và kỹ thuật sắc kỹ lớp mỏng thu được 2 hợp chất đặt tên là AC-T1 và AC-T2. Thơng qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân xác định được cấu trúc của AC-T1 là 3,3',4',5,6,7 – hexamethoxyflavone, AC-T2 là Carambolaside Q. 4.3.1 Về hợp chất AC-T1 (3,3',4',5,6,7 – hexamethoxyflavone)
3,3',4',5,6,7–hexamethoxyflavone tên theo danh pháp IUPAC là 2-(3,4- dimethoxyphenyl)-3,5,6,7-tetramethoxy-4H-chromen-4-one là một flavonoid, đã được phân lập từ Vitex negundo L. họ Lamiaceae, Citrus unshiu L. Rutaceae. Đây là lần đầu tiên hợp chất AC-T1 được phân lập từ lá của cây khế (A.carambola). Theo nghiên cứu của Ming Tan và cộng sự năm 2021, hợp chất AC-T1 được chứng minh là có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của virus HBV dựa vào kết quả thí nghiệm về sự suy giảm về kháng nguyên
36
HBsAg, cùng với giảm số lượng của vật chất di truyền trong thí nghiệm RT-PCR. Kết quả thực nghiệm in vivo đã chỉ ra rằng khi thử nghiệm trên đối tượng thí nghiệm là chuột ở mức liều 2,5mg/kg thì chỉ số HBsAg giảm cịn 74,45% [18]. Hợp chất AC-T1 cịn có khả năng chống viêm thơng qua ngăn chặn sự sản sinh các chất trung gian hóa học gây viêm như NO và PEG2, đồng thời AC-T1 cũng làm giảm sự biểu hiện của TNF-α, IL-6 và IL-1β. Nghiên cứu của Son, E. S và các cộng sự đã chỉ ra rằng AC-T1 có tác dụng làm ức chế sự hình thành của NO và PEG2 thơng qua việc giảm sự biểu hiện của iNOS và COX-2, quá trình này phụ thuộc vào nồng độ của AC-T1. Kết quả RT-PCR đã thể hiện được kết quả này. AC-T1 cũng được chứng minh có tác dụng hạn chế hoạt động của các chất tiền viêm như TNF-α, IL-6 và IL-1β. Thí nghiệm kiểm định PCR đã cho thấy AC-T1 ở mức liều 100mM đã chứng minh được kết quả này [19]. Tuy nhiên vẫn cần nghiên cứu chuyên sâu hơn về tác dụng sinh học của hợp chất này.
4.3.2 Về hợp chất AC-T2 (Carambolaside Q)
Carambolaside Q tên theo danh pháp là phloretin 3′-C-[(2-O-trans-p-coumaroyl)- β- D-fucopyranosyl]-6′-O-β-D-fucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabifuranoside, là một hợp chất thuộc nhóm dihydrochalcone C-glycosid. Trước đây Carambolaside Q đã từng được chiết xuất từ quả khế, tuy nhiên đây là lần đầu tiên phân lập được hợp chất này trong lá khế. Trên thế giới các nghiên cứu về tác dụng sinh học của AC-T2 rất hạn chế. Cho đến hiện nay, hợp chất này mới chỉ được nghiên cứu về tác dụng chống oxi hóa thơng qua tác dụng bắt giữ gốc tự do DPPH, ABTS và tác dụng khử sắt (FRAP) cho kết quả nồng độ ức chế IC50 tương ứng là: > 100 µM; 2,7 µM và 0,2 mmol/g, khi so sánh với chất tham khảo là L-ascorrbic acid với giá trị IC50 tương ứng là: 39,5 ± 0,5 µM; 10,5 ± 0,1 µM và 11,3 ± 0,1 mmol/g. Kết quả này cho thấy hợp chất carambolaside Q có tác dụng bắt giữ gốc tự do ABTS và khử sắt (FRAP) rất mạnh, tương tự như các hợp chất cùng cấu trúc phloretin C-glycosides khác như carambolaside M, N, O, P. Bên cạnh đó tác dụng ức chế enzyme lipase của tuyến tụy của hợp chất này cũng đã được công bố. Ở hai mức liều thử nghiệm là 50 và 100 µM cho kết quả ức chế tương ứng đạt 27,3 ± 0,2 µM và 51,7 ± 0,0 µM và giá trị IC50 là 99,6 ± 6,1 µM, cao hơn rất nhiều do với chất tham khảo orlistat, một thuốc phịng ngừa béo phì, với giá trị IC50 là 1,6 ± 0,1 µM. Nghiên cứu này cho thấy carambolaside Q cho tác dụng ức chế enzyme lipase yếu [16].
Từ các nghiên cứu đã được công bố trên thế giới cho thấy, các dihydrochalcone C- glycosid là nhóm hoạt chất flavonoid chính có trong cây khế. Các nghiên cứu trước đây đã phân lập được khoảng hơn 20 hoạt chất thuộc nhóm này trong các bộ phận của cây khế chủ yếu là lá và quả [5]. Các chất nhóm caramboalside được chứng minh có tác dụng chống
37
oxy hóa rất mạnh có thể ngăn ngừa viêm da do ơ nhiễm khơng khí và lão hóa sớm. Thử nghiệm đã cho thấy một số hợp chất nhóm carambolaside như carambolaside I, P, B, J có tác dụng ngăn chặn q trình cacbonyl hóa protein được gây ra bởi NaClO, khí thải động cơ xăng(GEEG). Hơn nữa thành phần caramboalaside P cịn được chứng minh có tác dụng làm giảm hoạt động của các chất trung gian hóa học gây viêm như IL-1, COX-2 [29]. Như vậy có thể nhận thấy, nhóm hợp chất này rất tiềm năng và có nhiều tác dụng sinh học thú vị cần được nghiên cứu và làm sáng tỏ hơn về thành phần hóa học và cơ chế tác dụng.
38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Bằng phương pháp định tính hóa học, đã xác định trong lá Khế có chứa các nhóm hợp chất: chất béo, phytosteroid, saponin, flavonid, đường khử tự do, coumarin, tanin, polysacrcharid và alkaloid
2. Từ phân đoạn etylacetate đã phân lập được 2 hợp chất là AC-T1 và AC-T2
3. Bằng vào kỹ thuật phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và các dữ liệu đã có có thể xác định được hợp chất hợp chất AC-T1 là 3,3',4',5,6,7 – hexamethoxyflavone, AC- T2 là Carambolaside Q,
Kiến nghị
Do thời gian có hạn, các kết quả nghiên cứu thu được còn khiêm tốn. Cần tiếp tục thực hiện nghiên cứu các nội dung:
+ Nghiên cứu tác dụng sinh học của cao tổng, các cao phân đoạn và các hợp chất phân lập từ lá Khế.
+ Tiếp tục phân lập các hợp chất trong phân đoạn ethyl acetat và các phân đoạn còn lại của lá Khế.
39
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Duy, H. A., & Nhi, N. T. T. (2018). Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học và