CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Các phương pháp đánh giá tiểu phân nano TCZ
2.3.2.1. Đánh giá kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân
Bốc hơi dung môi Pha ngoại
(Hịa tan chất diện hoạt/nước)
Nhũ hóa kết hợp đồng nhất
Tốc độ nhỏ giọt 2,5 ml/phút, nhiệt độ 5-10 ºC đồng thời siêu âm và khuấy từ
Tiểu phân nano TCZ Pha nội
(Hòa tan TCZ, EC/DCM)
16
Kích thước tiểu phân (KTTP) được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động. Khi chiếu chùm tia lase vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau. Bằng cách phân tích sự dao động của cường độ ánh sáng tán xạ có thể xác định được KTTP nhờ phương trình Stockes - Enstein [6].
Sử dụng máy phân tích kích thước tiểu phân Zetasizer Ultra đo KTTP trong khoảng 0,01 - 10000 nm, sử dụng cuvet nhựa. Trước khi đo, tiến hành pha loãng chế phẩm nhiều lần bằng nước cất sao cho chỉ số “Count Rate” nằm trong khoảng 200 - 400 kcps để kết quả mẫu đo thu được là chính xác nhất. Mẫu pha lỗng được đo ở điều kiện hệ số khúc xạ ánh sáng RI = 1,66; góc đo 173º; nhiệt độ đo 25 oC [6].
2.3.2.2. Đánh giá độ ổn định của hệ tiểu phân nano TCZ ở điều kiện thường
Các công thức sau khi bào chế xong được đựng trong các lọ thủy tinh đậy nút cao su và được để ở điều kiện nhiệt độ phòng. Các mẫu được đánh giá là tụ khi xuất hiện các tiểu phân lắng dưới đáy lọ thủy tinh.
2.3.2.3. Phương pháp định lượng TCZ I. Phương pháp định lượng TCZ
Tham khảo tài liệu [38] và điều kiện thực nghiệm, tiến hành định lượng TCZ trong các mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: Eclipse XDB-C18 250×4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 µm. - Pha động: MeOH – Đệm phosphat pH 3 (85:15, tt/tt).
- Detector UV: 220 nm. - Tốc độ dòng: 0,9 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl, tiêm mẫu tự động.
* Mẫu chuẩn:
- Cân chính xác khoảng 25,0 mg nguyên liệu TCZ, cho vào bình định mức 50 ml. Thêm khoảng 25 ml MeOH, lắc kỹ, đậy kín và siêu âm trong 10 phút cho tan hết. Bổ sung MeOH vừa đủ thể tích, lắc đều. Từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ chính xác khoảng 500 µg/ml, pha lỗng bằng pha động thành các dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng 10 đến 50 µg/ml, lọc dung dịch chuẩn qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm. Dịch lọc được tiêm sắc ký để xác định nồng độ TCZ trong dung dịch chuẩn.
* Mẫu thử:
- Mẫu TCZ phân tử tự do: Lấy chính xác 2,0 ml hỗn dịch chứa tiểu phân nano TCZ cho vào ống ly tâm có màng siêu lọc 10000Da. Tiến hành ly tâm 10000 vòng/phút trong thời
17
gian 30 phút ở nhiệt độ 25oC, lấy phần dịch lọc trong phía dưới màng siêu lọc tiêm toàn phần vào hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định nồng độ TCZ phân tử tự do.
- Mẫu TCZ tồn phần: Lấy chính xác 2,0 ml hỗn dịch nano sau khi bốc hơi hết dung mơi cho vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 70 ml MeOH, lắc kỹ, đậy kín và siêu âm trong 15 phút. Bổ sung MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 1,0 ml dịch trên cho vào bình định mức 10 ml, bổ sung MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm. Dịch lọc được tiêm sắc ký để xác định nồng độ TCZ.
II. Thẩm định một số chỉ tiêu phương pháp định lượng HPLC
a. Tính tương thích hệ thống
Tiến hành tiêm sắc ký mẫu chuẩn đối chiếu có nồng độ 40 µg/mL lặp lại 6 lần qua hệ thống sắc ký theo điều kiện sắc ký đã chọn. Yêu cầu độ lặp lại về diện tích pic và thời gian lưu giữa mỗi lần sắc ký có giá trị RSD khơng q 2% và hệ số bất đối xứng trong khoảng 0,8 – 1,5.
b. Độ đặc hiệu
Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn đối chiếu, mẫu TCZ nguyên liệu có nồng độ 40 µg/mL, mẫu thử và mẫu trắng theo điều kiện sắc ký đã chọn. Yêu cầu pic của TCZ xuất hiện trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn đối chiếu, mẫu chuẩn nguyên liệu, mẫu thử và không xuất hiện pic lạ tại thời điểm trùng với thời gian lưu của TCZ trên sắc ký đồ của mẫu trắng.
c. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Tiến hành sắc ký dãy chuẩn có nồng độ từ 10 – 50 µg/mL theo điều kiện sắc ký đã chọn. Xác định mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ TCZ trong mẫu.
d. Độ đúng
Tiến hành bào chế mẫu trắng khơng chứa dược chất tương tự như quy trình bào chế mẫu thử. Bổ sung một lượng TCZ nguyên liệu vào các mẫu trắng trên để thu được 03 mẫu trắng thêm chuẩn có hàm lượng tương ứng 80%, 100% và 120% so với hàm lượng TCZ trong mẫu thử. Tiến hành xử lý mẫu trắng thêm chuẩn này tương tự như quy trình xử lý mẫu thử. Chạy sắc ký các mẫu trắng thêm chuẩn này theo điều kiện sắc ký đã chọn. Yêu cầu phần trăm tìm lại của các mẫu ở 3 mức nồng độ nằm trong khoảng 98-102%.
e. Độ lặp lại
Chuẩn bị 6 mẫu dung dịch thử có nồng độ TCZ khoảng 40 µg/mL và chạy sắc ký theo điều kiện sắc ký đã chọn. Xác định nồng độ dung dịch từ phương trình hồi quy tuyến tính. u cầu độ lặp lại về hàm lượng TCZ trong các mẫu có giá trị RSD không vượt quá 2%.
18
2.3.2.4. Phương pháp xác định hiệu suất nano hóa và tỷ lệ dược chất nano hóa
Hiệu suất nano hóa (EE) và tỷ lệ dược chất nano hóa (LC) được định lượng gián tiếp thông qua việc định lượng dược chất phân tử tự do và lượng dược chất toàn phần trong hệ.
❖ Xác định lượng dược chất phân tử tự do:
- Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn TCZ có nồng độ chính xác khoảng 20 µg/mL, lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm.
- Mẫu thử: Tiến hành pha mẫu thử dược chất phân tử tự do và mẫu thử dược chất toàn phần như mục I ở 2.3.2.2.
* Tính tốn kết quả:
➢ Cơng thức tính lượng thuốc tự do trong mẫu thử:
mtd = Cc × Std
Sc × Vt
➢ Cơng thức tính lượng dược chất toàn phần trong mẫu thử:
mtp = 𝐶𝑐 ×Stp ×D
Sc × Vt
➢ Cơng thức tính hiệu suất nano hóa (EE):
EE (%) = mtp− mtd
mtp ×100%
➢ Cơng thức tính tỉ lệ dược chất nano hóa (loading capacity-LC):
LC (%) = mtpm− mtd
hệ ×100%
Trong đó:
mtd, mtp: Lượng dược chất tự do và toàn phần Cc: Nồng độ của dung dịch chuẩn (µg/ml).
Std, Stp Sc: Diện tích của mẫu thử, mẫu toàn phần và mẫu chuẩn (mAu.s). D: Hệ số pha lỗng.
Vt: Thể tích của mẫu thử (Hỗn dịch nano) (ml) mhệ = mtp + mEC (µg).
2.3.2.5. Đánh giá độ ổn định vật lý của hỗn dịch nano trong điều kiện khắc nghiệt
a. Đánh giá độ ổn định của tiểu phân nano trong điều kiện đông đá - rã đông
Tiến hành: Hỗn dịch nano sau khi bào chế được bảo quản trong lọ thủy tinh đậy nút cao su, cho vào tủ đông sâu -70ºC trong 12 giờ, sau đó để rã đơng ở nhiệt độ phịng. Lặp lại các bước như ở trên (đơng đá - rã đông) trong 3 chu kỳ. Sự thay đổi KTTP nano trước và sau
19
thử nghiệm được thể hiện bằng chỉ số Sf/Si, trong đó Sf là KTTP sau thử nghiệm, Si là KTTP trước thử nghiệm.
b. Đánh giá độ ổn định tiểu phân nano trong điều kiện tác động lực ly tâm mạnh
Dựa vào so sánh KTTP, PDI trước và sau thực nghiệm (TN): Chuẩn bị 3 ống ly tâm có dung tích 14 ml, sau đó hút 10 ml hỗn dịch nano cho vào các ống. Tiến hành ly tâm các ống với các thông số như sau: 3000 rpm/10 phút; 5000 rpm/10 phút; 10000 rpm/10 phút; 5000 rpm/20 phút; 5000 rpm/ 30 phút. Để xác định KTTP và PDI của hỗn dịch TCZ sau ly tâm, tiến hành hút 2 ml phần dịch bên trên của ống ly tâm (khoảng cách từ bề mặt đến chỗ hút khoảng 2 cm), pha loãng sao cho “Count rate” trong khoảng 200-400 kcps rồi tiến hành đo.
2.3.2.6. Phương pháp đánh giá một số đặc tính khác của tiểu phân nano
a. Đánh giá hình thái cấu trúc tiểu phân bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Nguyên tắc: Dùng chùm điện tử quét trên bề mặt mẫu nghiên cứu. Việc tạo ảnh được thực hiện thơng qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ sự tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật. SEM có thể phóng đại vật thể từ 10 lần đến 300000 lần. Do vậy, trên ảnh SEM thường có thang đo từ đó có thể tính tốn được kích thước thật của vật thể [5].
Tiến hành chuẩn bị mẫu: hỗn dịch nano TCZ được sấy khơ, mẫu sau đó được đưa lên khay nhôm nhỏ, và được bao phủ bởi một lớp platin mỏng trong mơi trường khí argon bằng thiết bị chuyên dụng. Quan sát mẫu bằng kính hiển vi điện tử quét FEI Quanta 200 có độ phóng đại 20x-800000x; độ phân giải δ = 1,0 nm; điện áp gia tốc 0,5-30 kV.
b. Đánh giá tương tác hóa học bằng phổ hồng ngoại FT-IR
Nguyên tắc: Kỹ thuật đo phổ hồng ngoại dựa vào hiệu ứng các hợp chất hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ hồng ngoại tạo ra các kiểu dao động và quay khác nhau, từ đó hình thành nên các dải phổ hấp thụ đối với từng chất.
Tiến hành:
- Chuẩn bị mẫu nano: Lấy hỗn dịch nano TCZ đem tiền đông trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ -70°C trong 12 giờ, rồi tiến hành đông khô với điều kiện nhiệt độ khoảng -50°C, áp suất 0,1 mbar sau 24 giờ sẽ thu được nano TCZ dạng bột khô.
- Chuẩn bị mẫu hỗn hợp vật lý (HHVL): phối hợp các thành phần nguyên liệu với tỷ lệ các thành phần giống như mẫu nano.
- Nghiền mịn mẫu cần đo (nguyên liệu TCZ, tá dược, HHVL và mẫu nano đơng khơ), sau đó trộn với bột KBr theo tỷ lệ 1:20 (w/w) rồi ép thành viên mỏng bằng máy dập viên cầm tay.
20
Tiến hành đo trong dải bước sóng 4000 – 400 cm-1. Sử dụng thiết bị phân tích hồng ngoại FT – IR 6700, Jasco (Nhật Bản). Quá trình đo diễn ra trong điều kiện độ ẩm dưới 60%.
c. Xác định đặc tính vật lý của tiểu phần nano
Phân tích nhiệt vi sai DSC (Differential Scanning Calorimetry) có thể được sử dụng để xác định bản chất và sự hình thành tinh thể bên trong nano thông qua việc đo nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh, nhiệt độ nóng chảy và các năng lượng enthalpy có liên quan của chúng [5], [39].
Tiến hành: Chuẩn bị mẫu nano đông khô tương tự như chuẩn bị mẫu nano đông khô mục 2.3.2.5.b. Mẫu cần đo (TCZ, tá dược, HHVL và mẫu nano đông khơ) được đặt trong đĩa nhơm có đục lỗ trên nắp, thực hiện đo trong khoảng nhiệt độ từ 40 –280°C, tốc độ gia nhiệt 10°C/phút, sử dụng dịng khí nitơ với tốc độ dịng khí là 50 mL/phút [10].