Đánh giá độ bền gấp
Cắt các mẫu có kích thước 1cm × 4cm. Gấp liên tục màng mỏng tại cùng một vị trí trên da một góc từ 0 o đến 180o cho đến khi màng mỏng bị phá vỡ. Số lần gấp ở cùng một vị trí đến khi màng bị phá vỡ là giá trị độ bền gấp. Đo 3 lần và lấy kết quả trung bình.
Đánh giá độ bền kéo
Thiết bị đo: Texture Analyzer (PL3).F
Thông số đo: chế độ đo: tension, giá trị mồi (trigger): 100,0 g, tốc độ kéo: 5 mm/s, khoảng cách biến dạng: 40 mm.
Màng được cắt thành những dải 1cm x 3 cm, kẹp mẫu vào 2 đầu kẹp sao cho khoảng cách giữa 2 đầu kẹp là 1 cm. Độ bền kéo được xác định bởi 2 thơng số: lực kéo rách và độ giãn kéo:
• Lực kéo rách = lực kéo để màng bị đứt (g).
• Độ giãn kéo = độ dài của màng tới khi đứt/ độ dài ban đầu của màng (%). Mỗi công thức được tiến hành đo 5 lần và lấy kết quả trung bình.
2.3.2.4. Đánh giá đặc tính của gel trên da thỏ
• Động vật thí nghiệm: thỏ khối lượng 2 - 2,5 kg, da lành lặn.
• Điều kiện thí nghiệm: nhiệt độ 25 ± 3oC, độ ẩm tương đối 40- 60%.
Tính kích ứng
- Cách tiến hành
Vùng da thử: Bôi 0,3 ml gel tạo màng trên diện tích 9 cm2 da lưng thỏ (đã làm sạch lông).
Vùng da chứng: 9 cm2 da lưng thỏ (đã làm sạch lông) không bôi gel tạo màng - Quan sát và ghi điểm.
Quan sát và ghi điểm phản ứng trên vùng da thử so với vùng da chứng kề bên ở các thời điểm 0 giờ, 1 giờ, 4 giờ và 24 giờ.
Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đỏ, phù nề theo bảng 2.3.
Phản ứng Điểm đánh giá
Sự tạo vẩy và ban đỏ
- Không ban đỏ 0
- Ban đỏ rất nhẹ (vừa đủ nhận thấy) 1
- Ban đỏ nhận thấy rõ 2
- Ban đỏ vừa phải đến nặng. 3
- Ban đỏ nghiêm trọng (đỏ tấy) đến tạo thành vẩy để ngăn ngừa sự tiến triển của ban đỏ.
4 Gây phù nề
- Không phù nề 0
- Phù nề rất nhẹ (vừa đủ nhận thấy) 1
- Phù nề nhận thấy rõ (viền phù nề phồng lên rõ) 2 - Phù nề vừa phải (da phồng lên khoảng 1 mm) 3 - Phù nề nghiêm trọng (da phồng lên trên 1 mm và
có lan rộng ra vùng xung quanh)
4
Tổng số điểm kích ứng tối đa có thể. 8
Những thay đổi khác trên da cần theo dõi và ghi chép đầy đủ. • Đánh giá kết quả
Điểm phản ứng được tính bằng tổng số điểm ở hai mức độ ban đỏ và phù nề. Chỉ sử dụng các điểm ở những thời gian quan sát ở 0 giờ, 1 giờ, 4 giờ và 24 giờ để tính kết quả.
Đối chiếu điểm kích ứng với các mức độ qui định trên bảng 2.3 để xác định khả năng gây kích ứng trên da thỏ của mẫu thử.
Bảng 2. 4. Bảng chia điểm mức độ kích ứng da
Loại phản ứng Điểm trung bình
Kích ứng khơng đáng kể 0 - 0,5
Kích ứng nhẹ > 0,5 - 2,0
Kích ứng vừa phải > 2,0 - 5,0
Kích ứng nghiêm trọng > 5,0 - 8,0
Đánh giá thời gian tạo màng trên da thỏ
Cách tiến hành
Bôi 0,1 ml gel lên trên vùng da lưng thỏ 12 cm2 (đã làm sạch lông).
Thời gian tạo màng được xác định từ khi bơi gel đến khi đặt một phiến kính trên màng (khơng có áp lực) khơng cịn nhìn thấy chất lỏng trên phiến kính sau khi nhấc lên.
2.3.2.5. Đánh giá khả năng khu trú
Bôi 0,02 ml gel thành trên vùng da được đánh dấu hình trịn đường kính 3 cm cách đường kẻ 1 mm tại mặt trong cẳng tay được mơ tả ở hình 2.3. Để tay thẳng đứng trong 2 phút, sau đó quan sát gel chảy qua vạch kẻ hay không để đánh giá khả năng khu trú của gel.
Hình 2. 3. Đánh giá khả năng khu trú
2.3.2.6. Đánh giá sơ bộ đặc tính của gel trên da người
Điều kiện thí nghiệm: nhiệt độ 25 oC ± 3oC , độ ẩm 40% - 60%.
Đánh giá thời gian tạo màng trên da người
Bôi 0,1 ml gel lên diện tích 12 cm2 phía trong cẳng tay, thời gian tạo màng được tính từ khi bơi gel đến khi đặt một phiến kính trên màng (khơng có áp lực) khơng cịn nhìn thấy chất lỏng trên phiến kính sau khi nhấc lên.
Đánh giá màng tạo thành
Bơi một lớp gel mỏng phía trong cẳng tay. Sau 30 phút, bóc lớp màng, quan sát.
Đánh giá khả năng giữ ẩm da của màng:
• Thiết bị đo: thiết bị nghiên cứu da Derma Combo. • Thơng số đo: chế độ Hydration
Bôi 1 ml gel thành một lớp mỏng, đều lên diện tích khoảng 35 cm2 ở mặt trong cẳng tay, bóc màng sau 4 giờ. Độ ẩm của da được đo tại một 1 vị trí đánh dấu ở thời điểm trước khi bơi gel và 5 phút sau khi bóc màng. Đơn vị đo: microsiemens (uS).
Đánh giá khả năng bị che phủ bởi mỹ phẩm nghiên cứu
Bôi 0,02 ml gel thành hình trịn đường kính 3 cm ở mặt trong cẳng tay. Sau khi màng hình thành, che phủ màng bởi lớp phấn mỏng. Đánh giá bằng cảm quan khả năng bị che phủ bởi mỹ phẩm của màng.
2.3.2.7. Phương pháp định lượng
Tiến hành pha đồng thời mẫu thử và mẫu chuẩn:
- Mẫu thử: cân chính xác khoảng 1,0 g gel cho vào bình định mức 20 ml, thêm khoảng 10 ml acetonitri, siêu âm 30 phút. Bổ sung vừa đủ acetonitri, lắc đều. Hút chính xác 2,0 ml dịch vào bình định mức 20 ml, bổ sung vừa đủ nước thu được dung dịch mẫu thử. Lọc dịch qua màng lọc nylon 0,45 μm.
3 cm
- Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 20 mg allantoin, hịa tan bằng nước trong bình định mức 20 ml thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1000 μg/ml (A). Hút chính xác 1,0 ml dung dịch A vào bình định mức 20 ml, bổ sung đủ thể tích bằng nước thu được dung dịch chuẩn trung gian nồng độ 50 μg/ml (S0).
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn trung gian (S0) pha dãy dung dịch chuẩn S1 đến S5 tương ứng với nồng độ 10, 8, 6, 4, 2 𝜇g/ml.
Định lượng allantoin bằng thiết bị phân tích sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu. Tham khảo và xây dựng lại dựa trên nghiên cứu của Z. Maksimovic và các cộng sự năm 2004, điều kiện sắc ký như sau: sử dụng cột sắc kí C18 5 μm (250 mm × 4,6 mm). Nhiệt độ duy trì ở 25 oC và bước sóng phát hiện ở 210 nm. Dung môi pha động là dung dịch đệm KH2PO4 0,01M điều chỉnh pH 3,5 bằng acid phosphoric. Tốc độ dòng cài đặt 0,8 ml/phút. Pha động được lọc qua màng lọc cellulose 0,45 μm và siêu âm đuổi khí trước khi sử dụng. Thể tích tiêm là 20 μm [21].
Thẩm định lại phương pháp định lượng bằng HPLC, tiến hành đánh giá trên chỉ tiêu:
Độ tuyến tính: tiến hành tiêm sắc ký 5 dung dịch chuẩn S1 đến S5 có nồng độ
allantoin khoảng 2 𝜇g/ml đến 10 𝜇g/ml, tiêm mỗi mức nồng độ 1 lần, ghi lại các sắc ký đồ và xác định đáp ứng pic. Yêu cầu đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa y (diện tích pic) và x (nồng độ allantoin) bằng phương pháp bình phương tối thiểu có hệ số tương quan tuyến tính R ≥ 0,995.
2.3.2.8. Khảo sát độ tan của allantoin
Hòa tan một lượng dư allantoin trong 50 g hỗn hợp dung môi ethanol và nước tỉ lệ (16:4)/ (15:5). Lọc qua giấy lọc thơ, lấy 1 ml dịch lọc pha lỗng 200 lần bằng nước cất. Định lượng nồng độ allatoin trong dịch lọc bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPMC Shimazu theo mục 2.3.2.7.
2.3.2.9. Định lượng dược chất trong chế phẩm
Mẫu chuẩn S1 và mẫu thử được định lượng dược chất theo phương pháp được trình bày ở mục 2.4.2.7.
Khi đó, hàm lượng dược chất có trong gel được tính theo cơng thức: 𝐻𝐿(%) = 𝑚!. 𝑆" .20
𝑆#. 𝑚 . 100
Trong đó: m: khối lượng gel định lượng (g)
𝑚!: khối lượng dược chất chuẩn (g).
2.3.2.10. Đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro
• Thiết bị
Hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research được sử dụng: ngăn chứa mẫu, ngăn nhận chứa môi trường khuếch tán, màng giải phóng được đặt giữa hai ngăn.
• Điều kiện tiến hành
- Màng giải phóng: màng lọc cellulose acetat kích thước lỗ xốp 0,45 µm. - Mơi trường khuếch tán: nước cất, duy trì ở 37 ± 1˚C.
- Thể tích mơi trường khuếch tán: V = 7 ml. - Diện tích bề mặt khuếch tán: 0,875 cm2. - Tốc độ khuấy từ: 400 vòng/phút.
- Khối lượng mẫu: 0,05 g gel. • Tiến hành
Thí nghiệm được tiến hành trong 4 giờ. Mẫu được lấy ở các thời điểm 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, mỗi lần lấy 0,5 ml dung dịch trong ngăn nhận đồng thời bổ sung 0,5 ml môi trường khuếch tán mới có nhiệt độ 37 ± 1˚C.
Mẫu lấy ra từ môi trường khuếch tán được định lượng bằng phương pháp được trình bày ở mục 2.3.2.7.
Cách tính tỷ lệ dược chất giải phóng tại các thời điểm
Tổng lượng dược chất đã giải phóng từ MIG tại lần lấy mẫu thứ n:
𝑄$ = 𝑉. 𝐶$ + 𝑣. -$&'𝐶%
%(' Trong đó:
Qn: tổng lượng dược chất đã giải phóng ở lần lấy mẫu thứ n (µg) V: thể tích mơi trường khuếch tán (V = 7 ml)
v: thể tích mỗi lần lấy mẫu (v = 0,5 ml)
Cn: nồng độ dược chất trong mơi trường khuếch tán lần lấy mẫu thứ n (µg/ml) Ci: nồng độ dược chất trong mơi trường khuếch tán tại thời điểm i (µg/ml) Phần trăm dược chất đã giải phóng từ MIG tại lần lấy mẫu thứ n:
𝑋$ =𝑄$
𝑀 . 100%
Trong đó:
Xn: phần trăm dược chất giải phóng tại lần lấy mẫu thứ n (%) Qn: lượng dược chất đã giải phóng ở lần lấy mẫu thứ n (µg) M: khối lượng dược chất có trong mẫu (µg)
2.3.3. Xử lí số liệu
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát phương pháp định lượng allantoin 3.1. Khảo sát phương pháp định lượng allantoin
Dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt 2, 4, 6, 8, 10 μg/ml được chuẩn bị theo phương pháp được trình bày ở mục 2.3.2.7.
Đáp ứng pic của dung dịch chuẩn có nồng độ 10 μg/ml được tiến hành theo phương pháp được trình bày ở mục 2.3.2.7. Kết quả được trình bày ở hình 3.1 cho thấy thời gian lưu của allantoin khoảng 3 phút, pic cân đối, tránh được sự ảnh hưởng của các pic nhiễu đường nền.