- Điều trị bướu lành tuyến tiền liệt
3.3 Phương pháp PCR
Tất cả các chủng c.botulinum được nuôi cấy ứong 10 ml Tryptose- Peptone- glucose- Yeast extract (TPGY) và ủ ứong điều kiện kỵ khí ở 37°c trong 24-48h, tiếp theo nuôi qua đêm (20 giờ ở nhiệt độ tương ứng).
Bướcl. Chuẩn bị khuôn mẫu: Lấy 1 ml dung dịch chứa tế bào từ môi trường, rửa
sạch với 1 ml đệm TE (0,01 M Tris-HCl, EDTA 0,001 M ,PH 8.0) trong 1 giờ ở 37°c và ngâm trong 1 ml nước cất. Ngoài các tế bào riêng rẻ được phân lập của từng chủng vi khuẩn, ba hỗn hợp được phân lập chứa các c.botulinum thủy phân protein loại A, B và F, các c.botulinum không thủy phân protein loại B, E , và F hoặc tất cả bốn huyết thanh đã được chuẩn bị bằng cách trộn riêng rẻ các tế bào được phân lập. Mọi các tế bào phân lập được đun nóng ở 99° c trong 10 phút để chia tế bào và phát hành các DNA của vi khuẩn và đã ly tâm trong 5 phút ở 10.000 X g. Một khối lượng của lịil của nổi trên mặt từng được sử dụng như bản mẫu trong hỗn hợp PCR. Tất cả được đun nóng ở 99°c trong 10 phút nhằm phá vỡ tế bào và tách chiết DNA của c.botulỉnum. Ly tâm trong 5
phút ở 10.000 vòng/phút. Khoảng 1 Ịil dịch nổi trên mặt được sử dụng như bản mẫu trong hỗn họp PCR.
Bước2. Mồi: Dựa trên cơng bố trình tự DNA của gen BoNT, bốn cặp mồi mới
với nhau được cụ thể cho cả hai loại c. botulỉnum A, B, E, hoặc F được thiết kế (Bảng 2)
Bảng 2: Môi cho multiplex PCR của c.otulinum loại A, B, E và F Loại Mồi
Nhiệt Chuỗi ( 5- 3 ’ ) Produrct Vị ừí Đ Ộ G C
Size (bp) (mã vùng) ( °C)ừên gen (%)
AfCBMLA1