I. Báo cáo thống kê kết quả thực nghiệm của đề tài
2. Kết quả và thảo luận
2.1.3. Kết quả Biện luận
2.1.3.2. Cấu trúc chủng nấm men P Pastoris X33 biểu hiện
Plasmid pPICZα/pdgf tái tổ hợp (Bộ môn Công nghệ sinh học phân tử và môi trường, ĐH KHTN, ĐHQG Tp. HCM) được thu nhận từ tế bào E. coli bằng phương pháp SDS-kiềm nhằm chuẩn bị cho quá trình biến nạp vào tế bào chủ nấm men. là plasmid sát nhập vào bộ gen của tế bào chủ thông qua sự tái tổ hợp tương đồng. Để nâng cao hiệu suất tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành cắt plasmid bằng enzyme SacI nhằm đưa plasmidpPICZα/pdgf về dạng thẳng trước khi biến nạp (hình 2.2.). Plasmid pPICZα/pdgf dạng thẳng được điện biến nạp vào tế bào chủ như đã trình bày ở trên. Thực hiện song song một mẫu đối chứng âm với tế bào khả nạp P. pastoris X33 không thêm plasmid. Các thể biến nạp được sàng lọc dựa trên khả
năng kháng kháng sinh zeocine (hình 2.32.)
Hình 2.2. Kết quả xử lý pPICZαA/pdgf với SacI
Với cấu trúc của vector PICZαA sau khi mở vòng plasmid PICZαA/pdgf tái tổ hợp và biến nạp, nếu cấu trúc dung hợp gene được sát nhập vào bộ gene của tế bào chủ nấm men, gene ZeoR mã hoá cho Sh ble protein qui định đặc điểm sàng lọc các thể biến nạp mang cấu trúc gene chèn. Do đó, chỉ những tế bào X33 có mang plasmid pPICZαA/pdgf sát nhập vào bộ gen và biểu hiện gen ZeoR mới có thể sống sót và hình thành khuẩn lạc trên môi trường chứa zeocine 100 (đĩa B, hình 2.3.).
Trong khi đó, trên đĩa đối chứng (đĩa A, hình 2.3.) tế bào P. pastoris X33 không
chứa gen kháng Zeocine nên không thể tăng trưởng được dưới áp lực chọn lọc
1 2 3 4 5 Giếng 1: Thang chuẩn DNA 1kb plus
Giếng 2: Plasmid pPICZα
Giếng 3: Plasmid pPICZα xử lý với SacI Giếng 4: Plasmid pPICZα/pdgf
59
Zeocine. Trong thí nghiệm này, chúng tơi thu nhận được 20 thể biến nạp nấm men
P.pastoris X33 mang pPICZαA/pdgf sát nhập vào bộ gen.
Hình 2.3. Kết quả biến nạp pPICZαA/pdgf vào P. pastoris X33
A. đĩa đối chứng, B. đĩa biến nạp plasmid pPICZαA/pdgf
Hiệu suất biến nạp được đánh giá bằng tỉ lệ số lượng các tế bào biến nạp thành công và các tế bào khả nạp X33 không thêm plasmid được shock điện với cùng điều kiện. Kết quả hiệu suất biến nạp được thể hiện trên bảng 2.1.
Bảng 2.1. Kết quả hiệu suất biến nạp
Chủng Số tế bào khả nạp
sau shock điện
Số tế bào biến nạp được
Hiệu suất biến nạp
X33 162 x 103 20 0,01%