6. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN NẤM MEN 1 Hệ thống vật chủ Pichia pastoris
6.3.1.2. Tạo dòng và biểu hiện glucanase trong các vật chủ khác
Glucanase được phân bố rộng rãi trong số các loài vi khuẩn, nấm và thực vật bậc cao, nhiều trong số chúng đã được tinh sạch và mô tả đặc điểm. Trên thế giới, việc tạo dòng và biểu hiện các gen này trong một đối tượng khác nhằm khai thác tối đa hiệu suất của glucanase đã được quan tâm nghiên cứu. Các vật chủ thường được chọn để biểu hiện gen này là các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh như E. coli, nấm
men...
Hai gen mã hóa endo-β-1,4-glucanase, egl1 và egl3, từ nấm sợi T. reesei được Penttila và cs (1987) biểu hiện trong nấm men S. cerevisiae dưới sự điều hòa của promoter phosphoglycerate kinase của nấm men. Enzyme EGI và EGIII dạng hoạt động đã được nấm men tạo ra và tiết vào mơi trường ni cấy. Enzyme tái tổ hợp EGI có kích thước lớn hơn và đồng nhất hơn dạng enzyme tự nhiên, điều này là do sự khác biệt trong mức độ hậu dịch mã (N-glycosylation) giữa chúng [61].
De la Cruz và cs (1995) đã phân lập và tạo dịng gen mã hóa endo-β-1,3- glucanase, BGN13.1, từ chủng T. harzianum CECT 2413 trong S. cerevisiae. Enzyme này có khối lượng phân tử 77,927 Da [24]. Fuglsang và cs (2000) đã phân lập và tạo
dịng gen mã hóa α-1,3-glucanase (mutanase) từ hai chủng T. harzianum CBS 243.71 và
P. purpurogenum CBS 238.95 trong hai chủng A. oryzae JaL142 và JaL125 [28]. Bên
cạnh đó, nghiên cứu tạo dịng và biểu hiện gen mã hóa exo-α-1,3-glucanase (AGN13.2) từ T. asperellum T32 cũng đã được Luis và cs (2004) tiến hành [69].
Năm 1997, Saloheimo và cs đã tạo dòng cDNA của gen cellulase từ T. reesei và thu được hoạt tính endoglucanase khi biểu hiện trong nấm men. Enzyme này được đặt tên là EGIV có khối lượng phân tử khoảng 56 kDa và gen tương ứng là egl4. Gen egl4 ở T. reesei đã chứng tỏ có cùng kiểu điều hịa với những gen cellulase khác trong loài nấm
này [66].
Okada (1998) cũng đã nghiên cứu biểu hiện gen β-1,4-glucanase từ T. reesei. Đoạn cDNA được xác định chứa khung đọc mở 702 bp mã hóa cho propeptide 234 amino acid. Trình tự protein tương ứng được xác định là cùng họ H của endo-β-1,4- glucanase. cDNA của gen egl3 được tạo dòng trong vector biểu hiện pGAD10α và biểu hiện trong E. coli, S. cerevisiae và Schizosaccharomyces pombe dưới sự kiểm soát của các promoter tương ứng tac, alcohol dehydrogenase (ADH1), và promoter human
cytomegalo virus. Kết quả enzyme EGIII tạo ra được xác định có khối lượng phân tử
khoảng 25, 28, và 29 kDa tương ứng ở các chủng E. coli, S. cerevisiae, S. pombe [59]. Kwon và cs (1999) đã tiến hành nghiên cứu sự biểu hiện và mơ tả đặc tính của endoglucanase I (EGI) từ T. viride HK-75. Gen egl1 gồm 1392 bp được biểu hiện trong E.
coli. Kết quả thu được một lượng lớn protein khơng qua q trình glycosyl hóa (non-
glycosylation) có khối lượng phân tử khoảng 62,5 kDa. Sau khi xử lý và tinh sạch thu được enzyme tái tổ hợp EGI dạng hoạt động với nồng độ 18,3 mg/ml trong môi trường nuôi cấy. Enzyme tái tổ hợp này (rEGI) có hoạt tính phân giải CMC đạt 67,8% so với dạng tự nhiên (nEGI) [44].
Năm 2001, Karlsson và cs cũng đã nghiên cứu sự biểu hiện gen và tinh sạch enzyme Cel61A (EGIV) của T. reesei. Enzyme được biểu hiện ở nồng độ cao với đuôi histidine ở đầu C-terminus và tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực. Enzyme EGIV
thu được đã thể hiện hoạt tính endoglucanase trên các cơ chất như CMC, hydroxyethylcellulose (HEC) và β-glucanase [39].
Ganiger và cs (2008) đã tiến hành tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa endoglucanase từ những lồi Trichoderma trong S. cerevisiae INVSc1 sử dụng vector tạo dòng pTZ57R/T và vector biểu hiện pYES2/CT. Kết quả cho thấy hoạt tính của β-1,6 endoglucanase của dòng tái tổ hợp từ T. reesei tăng ba lần, từ T. harzianum và T. virens tăng hai lần so với đối chứng [29]. Gen mã hóa enzyme ngoại bào exo-β-1,3-glucanase (tag83) được sản xuất bởi T. viride [43], và từ T. asperellum cũng đã được nghiên cứu. Hoạt tính của enzyme này được phát hiện trong tất cả các nguồn carbon, nhưng hoạt tính cao nhất được tìm thấy khi sử dụng tinh bột và thành tế bào của R. solani. Điện di khơng biến tính đã cho thấy sự xuất hiện một băng đậm của enzyme này. Các thí nghiệm sử dụng RT-PCR cho thấy exo-β-1,3-glucanase cảm ứng trong T. asperellum xảy ra ở mức độ dịch mã và sự biểu hiện của gen tag83 tăng lên có ý nghĩa khi có sự hiện diện của R. solani [57].
Zhou và cs (2010) đã sử dụng Bombyx mori để sản xuất endo-β-glucanase II tái tổ hợp (rEGII). Gen mã hóa EGII (egl2) được tạo dòng từ T. reesei và chèn vào genome của
B. mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) sử dụng vector biểu hiện BmNPV/Bac-to-Bac.
Để biểu hiện rEGII, tế bào BmN và ấu trùng của B. mori được cho nhiễm với virus tái tổ hợp, sản lượng rEGII thu được là 386 µg/ấu trùng và hoạt tính của rEGII tinh sạch khoảng 352 U/mg. Hoạt tính tối ưu của enzyme này đạt được ở 55oC và pH 4 [75].