2.1. Vật liệu nghiên c u ứ
2.1.1. Mẫu nƣớc m m ắ
Các mẫu nước mắm được thu th p t Cát Hậ ừ ải, H i Phòng và C a H i, Ngh ả ử ộ ệ
An và m t m u Phú Qu c, ộ ẫ ở ố Việt Nam ở các tháng lên men th ứ 2 đến tháng th ứ8 tùy m u, t i ẫ ạ thời điểm tháng 8 năm 2016.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị nghiên c u ứ
Hóa ch t ấ và enzyme: đường glucose, agar, cao n m men ấ (Việt Nam); c ao thịt, skim m (Biokar Dianogstique, Pháp) Tween 80, pilk ; epton, NaCl, CH3COONa, C6H17N3O7, MgSO4, MnSO4, CaCO3 (Trung Qu cố ), bộ kit tinh sạch DNA từ gel agarose của Thermo scientific (Mỹ); enzyme: RNAase, Taq DNA polymerase (Thermo scientific, Mỹ), bộ kit sinh hóa API 50 CHL (Biomerieux, Pháp).
Thiết bị nghiên cứu: cân điện tử Sartorius, Thụy Sĩ ( ); máy đo pH (Mettler Toledo, Mỹ); nồi hấp tiệt trùng, tủ ấm, kính hiển vi quang học, máy đo OD, máy voltex (Nga); tủ an toàn sinh học (Nhật); máy ly tâm lạnh, máy siêu âm (Mỹ); bể ổn nhiệt (Đức) b; (Anh); đĩa
(Đức, Trung Quốc) và một số thiết bị nghiên cứu cơ bản khác thuộc Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học 101,102 C10.
2.1.3. Môi trƣờng nghiên cứu.
Môi trường phân lập: MRS bổ sung CaCO3 .
Môi trường nuôi cấy tăng sinh: MRS bổ sung 10% NaCl
Mơi tường thử hoạt tính protease (FB25).
Thành phần và phương pháp chuẩn bị môi trường được thể hiện trong Phụ
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thu thập và chuẩn bị ẫ m u
Các mẫu nước mắm được rút từ chượp ở các tháng khác nhau: tháng thứ 2, 4, 6, 8 ở các chượp mắm Cát Hải, tháng thứ 3, 5, 7 ở các chượp mắm Cửa Hội chứa
trong các ống fancol vơ trùng, đậy nắp kín và bảo quản ở nhiệt độ 4oC cho đến khi tiến hành thí nghiệm trong vòng 180 ngày.
2.2.2. Phân lập vi khu n lactic t các mẩ ừ ẫu nƣớc nƣớc mắm
Các mẫu nước mắm được p ồng độ trải đều 100µl dịch trên mơi trường MRS b sung CaCOổ 3
(Yongsawatdigul, 2006), ang tr sau đó n
° - Các khu n l c m c riêng r có nhẩ ạ ọ ẽ ững đặc điểm đặc trưng của vi khu n lactic ẩ như hình trịn, màu trắng đục, nh n và có vịng phân ẵ
gi CaCOải 3 được c y tinh sấ ạch MRS . Các ch ng ủ
phân lập được nuôi trên cùng môi trường và lưu trữ trong 10% glyxerol -20°C ở để
tiến hành các nghiên c u tiứ ếp theo. Trước khi th nghi m ho t tính phân gi i ử ệ ạ ả
protein, các chủng được nghiên cứu hình thái và ho t tính sinh catalase. ạ
2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh các ch ng LAB phân llý ủ ập
đƣợc
2.2.3.1. Đặc điểm hình thái các ch ng phân lủ ập được
Hình thái khu n lẩ ạc: Các ch ng vi khu n ủ ẩ được ni cấy trên mơi trườ
- Hình thái khu n l c c a vi khuẩ ạ ủ ẩ
ớc vịng phân gi i CaCO3ả .
Hình thái t bào:ế Các ch ng vi khuủ ẩn được nuôi cấy trên môi trường MRS
3 , với điều kiệ ° - . T bào vi khu n trong các khu n lế ẩ ẩ ạc được c nh trên tiêu bố đị ản theo phương
2.2.3.2. Xác định kh ả năng sinh catalase các chủng LAB phân lập được
Nhỏ ự tr c ti p m t gi t dung d ch H2O2 3% lên trên khu n l c c a các ch ng ế ộ ọ ị ẩ ạ ủ ủ đã được phân l p, ghi nh n s s i b t khí n u có x y raậ ậ ự ủ ọ ế ả . Đọc k t qu th nghi m là ế ả ử ệ
(+) khi có hiện tượng s i b t khí do Oủ ọ 2đượ ạo ra, ngượ ạc t c l i là (-) khi khơng có s ự
sủi bọt khí.
2.2.3.3. Khảo sát kh ả năng chịu m n c a các ch ng LAB phân lặ ủ ủ ập được
Nuôi c y các chấ ủng LAB trong môi trường MRS l ng t i hai nỏ ạ ồng độ muối khác nhau là 10% và 18% 30ở oC dưới điều ki n y m khí. ệ ế Đo pH và độ đục để dánh giá kh ả năng sinh trưởng của các chủng tại độ ặ m n khác nhau.
2.2.4. Phƣơng pháp đánh giá khả năng sinh enzyme c a các ch ng LAB ủ ủ
phân lập đƣợc
2.2.4.1. Định tính kh ả năng sinh protease và lipase
Các ch ng phân lủ ập được nuôi cấy trên môi trường MRS agar b sung 10% ổ
NaCl, nuôi 30ở 0C, ở điều ki n y m khí, trong th i gian t 3-5 ngày. Kh ệ ế ờ ừ ả năng protease và lipase được ki m tra lể ần lượ trên mơi trườt ng MRS agar duy trì 10% NaCl, b sung 1% Skim milk và b sung 1% Tổ ổ ween 80. Nuôi ở các điều ki n trên ệ
và quan sát vịng phân gi i. ả
2.2.4.2. Ni cấy tăng sinh trong môi trường FB25
Các ch ng LAB ch n lủ ọ ọc được th nghi m cho ho t tính phân gi i protein s ử ệ ạ ả ử mơi trường nước lu c cá có ch a 25% NaCl (FB25). ộ ứ
cá và nước c t theo t l 1:2 ấ ỉ ệ
(w/w) b ngằ c, và
loại ổ sung ề
10C trong 15 (Udomsil N, 2011) [37].
Các ch ng ủ LAB được nuôi cấy trong môi trường MRS l ng ỏ chứa 10% NaCl trong 4 ngày. Sau đó, dịch ni c y ấ được ly tâm v i tớ ốc độ 6000 vòng/phút, 4ở oC,
trong th i gian 20 phút thu sinh kh i. Hòa tan sinh kh i ng dung dờ để ố ố tro ịch NaCl
0,9% ã ti t trùng và tiđ ệ ến hành pha loãng để đạ t giá tr ị OD OD600 = 0,95-1,05 (3x106 cfu/ml). Tiến hành c p gi ng vào ấ ố môi trường FB25 v t l 2% (v/v) và nuôi ới ỉ ệ ở 30°C trong 7 ngày dưới điều ki n y m khíệ ế . Độ pH c a FB25 sau 7 ngày c p gi ng ủ ấ ố được đo bằng máy đo pH. ật độ LAB được xác địM nh bằng phương pháp ấc y tr i ả
trên môi trường MRS ch a 5% NaCl và 0,5% CaCOứ 3 30°C trong 3-ở 5 ngày dưới điều ki n y m khí. ệ ế
2.2.4.3. Đánh giá khả năng sinh protease của c a các ch ng LAB ủ ủ
Các ch ng LAB sau khi kủ sinh trưởng trong môi trường
FB25 được ủy phân protein cá
ạ ợng oligopeptides được gi i phóng. ả
- Xác định hàm lượng protein: Mơi trường FB25 có b ổ sung các ch ng LAB ủ
sau 7 ngày nuôi được ly tâm v iớ ở điều
ki n nhiệ ệt độ 4oC, sinh kh i và ố các thu d ch n i. Dị ổ ịch
nổi được sót l iạ
Bradford s d ng huy t thanh bò ử ụ ế như một ch t chuấ ẩn [16]. Đường chu n ẩ được d ng theo Ph l c [17]. ự ụ ụ
- Xác định hàm lượng oligopeptidies Thêm oligopeptit trichloroacetic acid :
nổi cịn sót l i theo tạ ỉ
qua đêm ở 4oC, v iớ
thu d ch n iị ổ xác định hàm
lượng s d ng tyrosine làm ch t ử ụ ấ
chuẩn [16]. Đường chu n ẩ được d ng theo Ph lự ụ ục 2.
Hàm lượng các protein cịn sót lại và lượng oligopeptide gi i phóng ra so v i ả ớ
các giá trị đố i chứng tương ứng (FB25 khơng c p chấ ủng LAB) được tính và th hi n ể ệ
2.2.4.4. Thử nghi m kh ệ ả năng sinh aminopeptidase ộn i bào
Các chủng đã phân lập được nuôi tăng sinh trong môi trường MRS b sung ổ
10% NaCl, nhiở ệt độ 30oC, t 3-ừ 5 ngày, điều ki n y m khí. Dệ ế ịch ni được ly tâm v i tớ ốc độ 6000 vòng/phút, trong 20phút, 4ở oC, thu sinh kh i. Sinh kh i ố ố được thêm 250µl dịch enzyme lysozyme (5mg/ml) và 37ủ ở oC trong 1h. Sau đó ết bào vi sinh vật được r a 2 l n bử ầ ằng đệm phosphate 2M, pH =7,5. Thêm 2ml đệm phosphate trên và phá v t bào b ng máy siêu âm ỡ ế ằ bước sóng 100 Hz, 0ở oC trong 2 phú Lt. y tâm d ch sau siêu âm v i tị ớ ốc độ 6000 vòng/phút 4ở oC, thu d ch n i. D ch sau ly ị ổ ị tâm được dùng để xác định ho t tính c a enzyme aminopeptidase. ạ ủ
Hoạt tính aminopeptidase sinh ra được xác định b ng cách s d ng m t s ằ ử ụ ộ ố
d n xu t amino -ẫ ấ p nitroanilide như mô tả ủ c a Magboul và McSweeney (1999). M t ộ
ml h n h p ph n ng chỗ ợ ả ứ ứa 0,1 ml enzyme thô + 0,1 ml cơ chất (Glu- pNA, Leu- pNA nở ồng độ 20 mM) và 0,8 ml dung dịch đệm phosphate 0,2 M (pH 7,5). H n ỗ
h p ph n ợ ả ứng được ủ ở 60°C trong 2 gi ờ sau đó thêm 80% axit axetic vào để ng ng ừ
ph n ng. D ng t do cả ứ ạ ự ủa p-nitroanilide được đo bằng máy quang ph 405 nm. ổ ở
Một đơn vị hoạt độ enzyme (U) được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác thủy phân cơ chất gi i phóng ra 1 nmol -nitroanilide trong mả p ột phút ở điều ki n xác ệ định hoạ ột đ (Magboul và McSweeney, 1999, Sanz và c ng s , 1997) [20][28]. ộ ự
Hoạ ột đ enzyme được tính theo cơng th c: ứ
U= (U/ml). Trong đó: C: Nồng độ sản phẩm (nmol/ml). f: Hệ số pha loãng Vez: Thể tích enzyme (ml). t: Thời gian phản ứng (phút). V: Thể tích dịch phản ứng (ml).
2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh hóa và định danh các chủng LAB đƣợc tuy n ch n ể ọ
2.2.5.1. Xác định đặc điểm sinh hóa b ng Kit API 50 CHL ằ
Các ch ng LAB tuy n chủ ể ọn được tiến hành định xác định đặc điểm sinh hóa s d ng kit API50 CHL (Biomerieux) dùng cho vi khu n lactic. ử ụ ẩ
2.2.5.2. Định tên bằng phương pháp so sánh trình tự 16S DNA
Trình t gen 16S rRNA c a các chự ủ ủng LAB được khuếch đạ ằi b ng ph n ng ả ứ
PCR sử ụ d ng c p m i 27F và 1429R có trình t ặ ồ ự như trong ảB ng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S
rRNA.
Tên đoạn m i ồ Trình t m i ự ồ
27F 5’-TAACACATGCAAGTCGAACG- 3’
1429R 5’-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3’
S n ph m c a ph n ả ẩ ủ ả ứng PCR được ki m tra bể ằng phương pháp điện di trên
gel agarose 1,0%. Kích thước của các đoạn DNA thu được sau ph n ả ứng PCR được so sánh v i thang DNA chu n 1kb (ớ ẩ Thermo scientific, Mỹ). S n phả ẩm PCR được
tinh s ch b ng b kit PureLinkạ ằ ộ TM DNA Purification (Invitrogen, M ) và gi i trình – ỹ ả
t ên máy c trình t t ng ựtr đọ ự ự độ ABI PRISM®3100 Avant Genetic Analyzer Applied - (
Biosystems, Foster City, CA, Mỹ) tại Viện Công ngh sinh h c, Vi n Hàn lâm Khoa ệ ọ ệ
h c và Cơng ngh ọ ệViệt Nam. Trình t ự gen 16S rRNA được so sánh v i các trình t ớ ự tương ứng trên GenBank (NCBI) nh công c ờ ụ BLAST. Cây phát sinh chủng lo i ạ được thi t l p b ng ph n m m MEGA7, s dế ậ ằ ầ ề ử ụng phương pháp Neighbor-joining. Phân tích giá tr Bootstrap c a cây phát sinh ch ng loị ủ ủ ại được tính v i 1000 m u th ớ ẫ ử
2.2.6. Nghiên cứu ứng dụng các chủngđƣợc tuy n ch n trong lên men ể ọ
s n xuả ất nƣớc m m ắ
2.2.6.1. Chuẩn b ịgiống
Hai chủng được l a ch n là ự ọ CH2-4 và CH6-2 được nuôi c y trong ấ môi
trường FB25, pH 7,0 30°C trong 7-ở 10 ngày theo điều ki n yệ ếm khí để đạ t mật độ
t bào x p x ế ấ ỉ 105-106 CFU/ml. D ch lên men này ị được dùng làm gi ng khố ởi động
cho quá trình lên men nước mắm được th nghi m. ử ệ
2.2.6.2. Lên men nước m m ắ
Một kg cá cơm được rã đơng trong bình thủy tinh, trong b n nhi t 65°ủ ể ổ ệ C
cho đến khi nhiệt độ ủ c a mẫu đạt 65°C. Thêm 0,25% Alcalase 2.4L và trong 2 ủ
gi . S , các m u ờ au đó ẫ được làm nguội đến 50°C và thêm 0,5% Flavouzyme 500L, ủ ở 50°C trong 4 gi (Yongsawatdigul et al., 2007) [41]. Các mờ ẫu được gi nhiữ ở ệt độ phòng cho đến khi đạt được nhiệt độ 35°C, sau đó thêm 25% (w/w) NaCl và 10% (v/w) gi ng khố ởi động. Mẫu đối ch ng ứ được thêm 10% FB25 mà khơng có LAB. Q trình lên men nước mắm được thực hi n nhiệ ở ệt độ 35oC trong 6 tháng. S thay ự đổi vi sinh v t, ậ độ đạm, hàm lượng axit amin được theo dõi thở ời điểm 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 và 180 ngày lên men. Các h p ch t d ợ ấ ễ bay hơi của mẫu được phân tích thở ời điểm 30, 120 và 180 ngày. Các tính chất hóa lý khác như hàm lượng muối, màu sắc, nitơ amoni và hàm lượng nitơ tổng, được xác định 180 ngày lên ở
men [37 ].
Sau các th i quãng th i gian lên men (0, 15 , 30, 60, 90, 120, 150 và 180 ờ ờ ngày), tiên hành l y mấ ẫu (10g) trong điều ki n vô trùng và ti n hành ệ ế xác định hàm
lượng axit amin t ự do được sinh ra theo phương pháp ninhydrin dùng dùng glutamic 1mg/mL như một chất chu n. ẩ
Tiến hành: L y 0,1mL d ch th y phân cá + 1mL ninhydrin 2% + 1mL ấ ị ủ
phút, để nguội ở nhiệt độ thường, đo độ ấ h p th quang hụ ọc ở bước sóng 570nm.
Lượng axit amin được xác định theo đường chu n glutamic mô t trong Ph l c 2. ẩ ả ụ ụ Phương trình đường chu n thi t lẩ ế ập được:
Y= 19,794x + 0,2571; R2= 0,9933
Trong đó: Y là giá tr OD cị ủa m u ẫ
X là nồng độ axit amin (mg/ml) 2.2.7. Phƣơng pháp xửlý số u liệ
K t qu nghiên cế ả ứu được x ử lý theo phương pháp thống kê sinh h c trên ọ
ph n m m excel. Ph n m m s d ng các hàm tính tốn d a trên nh ng công ầ ề ầ ề ử ụ ự ữ
thức cơ bản c a thủ ống kê trong đó có cơng thức:
Giá trị trung bình ( ): Độ ệ l ch chu n ( ẩ ): Sai s ốm:
Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập vi khu n lactic t các mẩ ừ ẫu nƣớc nƣớc mắm
Vi khuẩn lactic được phân l p t ậ ừ chượp nước mắm ở các tháng 2,3,4,5,6,7,8 c a các mủ ẫu nước m m Cát H i và Vinh ắ ả trên môi trường MRS b sung NaCl và ổ
CaCO3theo phương pháp mô tả ở m c 2.1. K t qu ụ ế ả định lượng được thể ệ hi n trên B ng 3.1. S ả ố lượng vi sinh vật đếm được ở các mẫu nước m m khác nhau thì khác ắ
nhau. Điều này chứng t s ỏ ự đa dạng c a vi sinh v t trong v t liủ ậ ậ ệu thô cũng như
trong quá trình lên men. B sung CaCOổ 3 vào mơi trường MRS giúp trung hòa acid lactic do LAB t o ra, giúp duy trì pH tạ ối ưu. Hơn thế ữ n a ion Ca2+ được s d ng ử ụ
cho s v n chuyự ậ ển cơ chất của cầu khu n lactic (Teuber, 1995) [32]. ẩ
Bảng 3. . Lượng LAB trong các mẫu nước mắm 1
Mẫu nƣớc mắm
Thời gian lên
men Số lƣợng tế bào (log CFU/ml) Cát Hải 2 7.60 4 5.48 6 5.70 8 (Cat Hai) 4.56 8 (Phu Quo c) 4.11 Vinh 3 6.23 5 4.30 7 3.30
T k t qu bi u th trên B ng 3.1 ta thừ ế ả ể ị ả ấy LAB được tìm th y trong t t c ấ ấ ảcác mẫu nước thu thập được, mật độ dao động t ừ 3,3 đến 7,6 log (cfu/ ). ml Ở các chượp
ít ngày mật độ LAB cao và gi m d n theo th i gian lên men. Các mả ầ ờ ẫu nước mắm
nghiên c u c a Udomsil mứ ủ ật độ LAB thấp hơn dao động t 2.11- 4.26 log (cfu/ ) ừ ml tuy nhiên mật độ LAB khơng có xu hướng giảm theo th i gian ờ như trong nghiên
c u này [36]. ứ Điều này có th ể được gi i thích là do s khác nhau cả ự ủa nguyên li u ệ thô và phương pháp lên men giữa các nhà máy x n xuả ất nước m m [22]. ắ
3.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý các ch ng phân lủ ập đƣợc 3.2.1. Hình thái LAB 3.2.1. Hình thái LAB
Sau quá trình phân l p, 17 ậ chủng LAB được l a ch n ng u nhiên d a trên s ự ọ ẫ ự ự
khác bi t v hình thái khu n l c. Các khu n lệ ề ẩ ạ ẩ ạc được ria thuần khiết trên mơi trường MRS có b ổ sung 10 % NaCl, 0,5% CaCO3 , th ho t tính catalase, quan sát t bào ử ạ ế
bằng phương pháp nhuộm gram. B ng 3.2 và 3.3 mô t ả ả đặc điểm khu n l c và hình ẩ ạ
thái tế bào c a 17 ch ng l ch n. ủ ủ ựạ ọ
Bảng 3.2 Đặc điểm khuẩn lạc.
STT Tên chủng Khuẩn lạc Đặc điểm khuẩn lạc
1 CH2-1
Màu trắng, bóng, mùi hơi, hơi