2.9. Một sế nghiên cửu trong và ngoài nước về sự đa dạng của nấm
Metarhirium anừopUae dựa vào gen Prl và vùng rDNA-ITS
2.9.1. Nghiên cứu nước ngoàỉ
Savita Bagga, Gang Hu, Steven E. Screen, Raymond J. St.Leger đã phân tích sự giống nhau về mặt trình tự và cấu truc exon -intron các subtilisin của nấm M.anỉsopỉỉae và đã chia thành 4 nhóm:
Nhóm I gồm có PrỉC
Nhóm phụ I: gồm có PrlA, PrlB, PrlG, PrlI,PrlK. Nhóm phụ II gồm có PrlD, PrlE, PrlF, PrlJ.
Nhóm III gồm có PrlH có hoạt tính endocellular.
Cheng Wang, Milton A. Typas, Tariq M. Butt (2002) đã sử dụng kỹ thật Nested- PCR đế xác dị nh những đột biến ở hai gen PrlA và PrlB bằng cách sử dụng những cặp
pr imer chuyên biệt cho từng gen và kiểm tra bằng kỹ thuật Southern Blot . Ket quả: phát hiện được gen Prl ở dòng cha mẹ, khơng phát hiện được ở những dịng đột biển.Tuy nhiên hoạt tính của enzyme giữa dịng cha mẹ và dịng đột biến khơng thay đổi. Như vậy dòng đột biến nếu bị mất gen quan trọng nhấ t là gen Prl vẫn có thể gây
bệnh trên cơn trùng.
Sorayac c . M.. Leal và ctv (1997) đã mô tả một phương pháp để xác định những dòng nấm Metarhizium bằng cách sử dụng kỹ thuật RFLP để phân cắt sản phẩm PCR của gen Prl và phân tích những phân đoạn b ằng kỹ thuật điện di . Bằng kỹ thuật này 40
dòng nấm Metarhỉzỉum thu được từ 15 loại ký chủ khác nhau đã được xác định và chia làm 4 nhóm.
Chikako và Susumu Shimizu (2002) đã tiến hành khuếch đại vùng rDNA từ đầu 3’ của 18S rDNA tới đầu 5’ của 28S rDNA bằng cách sử dụng cặp mồi đặc hiệ u là TW 81 và AB28 và giải trình tự vùng 5.8S và vùng Flanking để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa nấm Metarhizium anisopliae được phân lập từ Nhật Bản và Hàn Quốc với các lồi có mối quan hệ.
Malena p. Panton, Annoula Mavridou, Milton A.Typas (2003) so sánh sự khác biệ trong trình tự của vùng IGS và vùng rDNA -ITS để nghiên cứu sự khác biệt về mặt di truyền của 40 dòng nấm Metarhizium.
N.D.Pipe, D.Chandler, B. w. Bainbridge và J.B.Heale (1995) sử dụng kỹ thuật RFLP-PCR để phân tích gen mã hóa cho ribosome RNA (rDNA) từ những dịng nấm
Metarhizium khác nhau như M.anisopliae var. anisopliae, M.anisopliae var. maịus, M.album và M./lavoviride có nguồn gốc từ nhiều quốc gia khác nhau.
Marilena Aquino de Muro, Samina Mehta, David Moore (2003) sử dụng kỹ thuật RFLP, giải trình tự và AFLP để phân tích vùng ITS của 50 dịng nấm Beauveria bassỉana. Trĩnh tự vùng ITS đã chỉ ra sự khác biệt về trình tự của các dịng B.bassỉana
thấp hơn 2%.
Mavridou và ctv (1998) đã phân tích sự đa hình trong lồi Metarhỉzium
anisopliae var. anisopliae bằng cách sử dụng phân tích RFLP đối với phức hợp gen
rDNA và mtDNA. Dựa vào việc phân tích sự lai của DNA , 25 dòng được chia làm 20 nhóm khác biệt về di truyền.
Driver và ctv (2000) đã sử dụng kỹ thuật RAPD và trình tự của tồn bộ vùng ITS của rDNA để xác định sự phân lồi . Những dịng nấm được chia thành 10 nhánh
Curran vàctv (1994) đã nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của nấm
Metarhizium bằng việc sử dụng trình tự rDNA.
Rakotonirainy và ctv (1994) đã phân tích sự khác biệt về isoenzyme và trình tự của ribosomal RNA trong giống nấm Metarhiiium.
2.9.2. Nghiên cứu trong nước
Những nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trong quần thể nấm Metarhizium
anisopliae dựa vào gen Prl và vùng rDNA -ITS ở Việt Nam có rất ít . Phần lớn những
nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Metarhizium anisopliae chỉ dừng
2.10. Phưong pháp phát hiện gen Prl và vùng rDNA-ITS
Có nhiều phương pháp khác nhau (như ELISA, allozyme electrophoresis hoặc RFLPs) có những ưu và khuyết điểm khác nhau, chỉ phân biệt giữa mỗi loài hoặc đòi hỏi số lượng lớn của DNA tinh khiết (Hegedus và ctv, 1993). Sự phân lập DNA thì tốn nhiều thời gian và giới hạn số lượng mẫu có thể phân tích được trong thời gian thích hợp. RAPD - PCR thì cũng được sử dụng để mơ tả đặc điểm những giống Metarhizỉum anisopliae. Tuy nhiên, RAPD - PCR rất dễ bị nhiễm tạp và thường không ổn định, chỉ
hợp kỹ thuật PCR và phân tích RFLP (RFLP - PCR), dựa trên sự khuếch đại của phần gen mã hóa chủ yếu là protease subtilisin Prl (St Leger và ctv, 1992) được tiết ra bởi nấm Metarhizium anisopliae và vùng ITS1- 5.8S - ITS2.CHƯƠNG 3. VẲT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• •
NGHIÊN CỨU
3.1. Thịi gian và địa điểm
3.1.1. Thời gian
Đề tài được tiến hành từ ngày 26 tháng 3 năm 2007 đến ngày 31 tháng 8 năm
nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2.Vầt liêu và hố chất
• ■
3.2.1. Vật liệu
DNA được ly trích từ những dịng nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên cơn trùng gây hại cây trồng theo quy trình của Leal, 1994 do anh Nguyễn Văn Lầm cung cấp và được trữ ở -20°c . Các mẫu nấm Metarhỉzỉum anỉsoplỉae được thu thập và phân lập trên một số côn trùng gây hại ở một số tỉnh thành trong nưóc.
Bảng 3.1: Nguồn nấm Metarhizium anỉsoplỉae được thu thập ở một số địa phương
Bọ dửa Brontispa ỉongissima Dừa Trà Vinh
Bọ dừa Brontispa longỉssima Dừa Tây Ninh
Bọ dừa Brontispa longissừna Dửa Bình Định
Bo xít đen ScQtmopham coartaía Fab. Lúa Trà Vinh
Bọ xít đen Scotmophara coartata Fab. Lúa Tiền Giang Slu cuốn lá Lúa Parnam gỉđỉata B&G. Lúa Long An
Rầy nâu Nủaparvata Itígens stal. Lúa Bến Tre
Rằy nâu Núaparvata hịgens stal. Lúa Long An
Bọ dừa Brontispa longissừna Dửa Quận 9 TP HCM
3.2.2. Hoá chất
Các hoá chất được sử dụng trong đề tài này được sản xuất bởi Cơng ty Sigma, Promega, Bio-Rad).
Hố chất cho phản ứng PCR (do công ty Promega cung cấp)
- dNTP (25 mM)
- MgCl2 (25 mM)
- Primer 1 (METPR1), primer 2 (METPR4), primer 3 (METPR2), primer 4 (METPR5), primer 5 (ITS 4), primer 6 (ITS 5)
Gel agarose, thường sử dụng gel có nồng độ 1% agarose.
Đệm TAE 0,5X dùng để pha gel agarose và làm dung dịch đệm trong chạy điện di với thành phần như sau:
✓ Tris HC1 4,48 g
✓ Na2EDTA 0,5M (pH8,0) 2ml
✓ Glacial acetic acid 1,14 ml
✓ Nước cất vừa đủ 1 lít
Dung dịch nhuộm gel: Ethidium bromide 1%. Ladder 3kb.
máy đo pH, máy lắc, máy ly tâm lạnh, máy khuấy từ, bộ điện di ngang HorizonR 558 (Life Technologies), máy PCR (BIO-RAD), máy vortex, máy chụp hình gel Bio -Rad, máy đọc trình tự ABI PRISM 3100, các loại pipette 0,5 ịú - 10 ịx\ và 10 ịú - 100 ịú, các loại đầu tip 0,5 ịủ - 10 pl và 10 ịủ - 100 ịủ.
rDNA-lTS của nấm Metarhỉzỉum anỉsopỉỉae.
2. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anỉsoplỉae dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS và gen Prl.
3.5. Phvtmg pháp nghỉên cứu
3.5.1. Kiểm tra
DNA tồng số được ly trích tử các dịng nấm Metarkỉrium anừopliae.
DNA tổng số được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1 % với hiệu điện thế 100V ữong 20 phút.
3.5.3.3.5.3. 3.5.4.
Khuếch đạỉ gen Prl