Can thiệp vào hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh

3. Cơ chế hoạt động của probiotics trong nuôi trồng thuỷ sản

3.7. Can thiệp vào hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh

Trong thập kỷ gần đây, cụm từ “quorum sensing” được nhắc đến như một q trình thơng tin giữa tế bào với tế bào vi khuẩn. Các phân tử dấu hiệu quorum sensing như AHL (N-acyl homoserin lactone) có liên quan đến quá trình điều hịa các nhân tớ gây độc ở nhiều vi khuẩn gây bệnh. Sự phá vỡ hệ thống quorum sensing được xem là một liệu pháp chống lại sự xâm nhiễm mới trong ni trồng thủy sản. Furanone bị halogen hóa được tạo ra bởi tảo biển đỏ

Delisea pulchra được xem là một chất ức chế quorum sensing đầy hứa hẹn. Khi

bổ sung hợp chất này với nồng độ đầy đủ bảo vệ Branchionus, Artemia không

bị ảnh hưởng bởi Vibrio.

3.8. Nâng cao chất lượng nước ao nuôi

Các chế phẩm probiotic cũng có tác dụng cải thiện môi trường nước ao nuôi trồng thủy sản. Trong nhiều nghiên cứu, chất lượng môi trường nước ao nuôi được cải thiện khi bổ sung probiotic, đặc biệt là sự bở sung chế phẩm có chứa các chủng Bacillus sp. vì Bacillus là vi khuẩn gram dương rất hiệu quả

trong việc biến đổi các chất hữu cơ thành CO2 so với vi khuẩn gram âm. Hơn nữa, các chế phẩm probiotic cũng có khả năng tạo nên sự cân bằng giữa NH3/NO2/NO3 trong nước với sự hiện diện của các vi khuẩn nitrate hóa như

Nitrosomonas sp. và Nitrobacter sp.. Trong điều kiện môi trường nước ao ni

có nồng độ NH3 cao, Nitrosomonas sp. sẽ chuyển đởi NH3 thành NO2, sau đó Nitrobacter sp. sẽ chuyển đổi NO2 thành NO3, là một hợp chất không gây độc

cho vật ni. Các chủng vi khuẩn nitrate hóa sẽ tiết ra polymer cho phép chúng gắn kết trên bề mặt và hình thành nên biofilm. Và chính biofilm này đã làm giảm đến 50% tỷ lệ ammonia và nitrite trong mơi trường ao ni. Ngồi các vi khuẩn nitrate hóa, các chủng vi khuẩn phân hủy sulfur, methane cũng có tác dụng cải thiện môi trường nước ao nuôi trồng thủy sản.

4. Phương pháp chọn lọc những dòng vi khuẩn hữu ích cho ni trờng thuỷ sản

Để sản xuất được một chế phẩm probiotic có được đầy đủ các tính chất và đáp ứng tớt đới với các lồi ni trồng thủy sản trong việc phịng và chớng lại các bệnh do vi sinh vật gây ra khơng là một chuyện đơn giản. Đó là q trình trải qua nhiều bước thử nghiệm phức tạp.

42

4.1. Thu thập các thông tin xung quanh

Hình 4.1: Sơ đồ chọn lọc probiotics

Trước khi thực hiện hoạt động nghiên cứu và phát triển chế phẩm probiotic, cần phải tiến hành các khảo sát khoanhh vùng hoạt động nuôi trồng hay phát triển kinh tế ở các trang trại thủy sản. Một cái nhìn tởng qt kết hợp với tư duy khoa học cùng những kiến thức sâu sắc về hoạt động nuôi trồng thủy sản là nền tảng để xác định các bước tiếp cận khả thi đến probiotic. Cần phải được xác định chính xác mơi trường sớng của các sinh vật nuôi cùng, hệ vi sinh vật, mối quan hệ giữa hệ vi sinh vật (mầm bệnh, các vi sinh vật khác) và vật chủ, mối quan hệ giữa hệ vi sinh vật và môi trường.

43

4.2. Phân lập các vi sinh vật tiềm năng

Phân lập các chủng probiotic từ những ao nuôi tốt là một trong những giai đoạn quan trọng nhất của tiến trình này. Giai đoạn này rất quan trọng vì các dịng được chọn lọc sẽ biểu hiện chức năng của probiotic, mặc dù khơng có những dấu hiệu rõ rệt nào chứng tỏ việc phân lập các chủng probiotic từ vật nuôi hay từ môi trường nuôi tốt sẽ tớt hơn việc phân lập từ các lồi hay các điều kiện ngoại cảnh khác. Tuy nhiên, có một sự logic trong việc phân lập các chủng probiotics là ở những nơi vật nuôi tăng trưởng tốt và điều kiện ao ni tớt thì các chủng probiotic có hiệu quả. Chính điều này chứng minh rằng chính các chủng này lấn át các chủng khác như trong cơ ruột của cá là một tác nhân tốt để ngăn chặn các mầm bênh từ vị trị gắn kết trên thành ruột. Tương tự, sự hiện diện của một dòng vi khuẩn ưu thế ở mật độ cao trong môi trường nuôi chứng minh khả năng tăng rưởng thành công dưới các điều kiện thông thường và cạnh tranh hiệu quả về dinh dưỡng với các dòng gây hại.

4.3. Đánh giá bước đầu trong phòng thí nghiệm

Sau khi phân lập các chủng vi sinh vật probiotic, giai đoạn sàng lọc và tiền chọn lọc từ các chủng giả định là một bước rất quan trọng để giới hạn lại số lượng số lượng vi sinh vật đã phân lập.

Thử nghiệm tính đối kháng trong điều kiện in vitro

Phương thức chung để sàng lọc các probiotic quan tâm là thực hiện các thử nghiệm tính đới kháng trong điều kiện in vitro trong đó chính các mầm bệnh là th́c thử để xác định các probiotic hay chính các sản phẩm ngoại bào. Dựa vào sự sắp xếp chính xác thứ tự của các thử nghiệm, các probiotic tuyển chọn có thể được chọn lọc dựa vào khả năng sản xuất các hợp chất ức chế, siderophore hay cạnh tranh về mặt dinh dưỡng.

Việc tiền chọn lọc các probiotic quan tâm dựa vào các thử nghiệm tính đới kháng trong điều kiện in vitro có thể chọn được các chủng probiotics hiệu quả. Tuy nhiên, sự liên kết giữa quá trình xác định một probiotic tốt và các tiêu chuNn tiền chọn lọc chưa rõ ràng. Mặt khác, điều này cũng không chứng minh được các chủng phân lập không ức chế các mầm bệnh trong thử nghiệm tính đới kháng in vitro ít hiệu quả hơn việc bảo vệ vật chủ chống lại các mầm bệnh trong điều kiện in vivo. Nó cũng khơng chứng minh rõ ràng q trình thực hiện các thử nghiệm in vitro có thể cung cấp thêm một tiêu chuNn trong quy trình chọn lọc. Các thử nghiệm in vitro âm tính lẫn dương tính cũng khơng dự đốn được ảnh hưởng trong điều kiện in vivo.

44

Khả năng các dịng vi khuẩn probiotic hình thành tập đồn vi khuẩn trên ruột hay trên cơ quan ngoại bào của vật chủ và khả năng gắn kết trên lớp cơ có thể là một tiêu chuNn tốt cho công tác tiền chọn lọc trong số các chủng vi khuẩn probiotic giả định. Điều này liên quan đến khả năng tồn tại của các probiotic tuyển chọn đối với vật chủ và môi trường nuôi, sự gắn kết trên bề mặt vật chủ, khả năng ngăn chặn các vi khuẩn gây bệnh.

Thử nghiệm quy mô nhỏ liên quan đến hệ thống nuôi đơn vật chủ

Các thử nghiệm quy mô nhỏ

Ấu trùng cá từ 6 đến 8 ngày tuổi được ni trong mơi trường có sự hiện diện của vi khuẩn phân lập. Sau 4 ngày, kiểm tra sức khỏe của ấu trùng bằng cách so sánh kính thước của chúng, khả năng bơi lội và mức độ thèm ăn. Từ đó, các vi khuẩn được xác định là mầm bệnh tiềm năng hay các chủng probiotic. Việc nuôi ấu trùng cá biển và thân mềm ở quy mô nhỏ cho phép sàng lọc nhiều chủng probiotics quan tâm hiện diện trên cơ thể vật chủ.

Monoxenic culture (Nuôi cấy đơn vật chủ)

Để xác định hiệu quả của một chủng vi khuẩn chuyên biệt cho sinh vật nuôi và loại trừ các vi khuẩn khác từ hệ thống nuôi trồng là rất cần thiết để tránh sự tương tác giữa các vi khuẩn.

Sự chọn lọc đầu tiên đối với các chủng probiotic tuyển chọn được thực hiện bằng cách nuôi các vật chủ trong điều kiện đơn vật chủ (monoxenic) tức là chỉ có sự hiện diện của một chủng probiotic giả định. Hướng tiếp cận này đã được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiều chủng vi khuẩn lên mơi trường nấm đơn bào, rotifer. Các thí nghiệm này được thực hiện trong điều kiện quy mô nhỏ nên tất cả các yếu tố đầu vào (nước, thức ăn …) được vô trùng và trứng, ấu trùng hay tảo đơn bào được thu hoạch dưới các điều kiện vô trùng trước khi thí nghiệm. Yếu tớ giới hạn trong giai đoạn này là sự thích hợp của sớ lượng lớn các sinh vật thuần khiết. Do đó, giai đoạn này chỉ được sử dụng với sinh vật sống làm thức ăn như tảo đơn bào, rotifer, artemia) hay ấu trùng thân mềm hay cá.

4.4. Đánh giá khả năng gây bệnh của dòng vi sinh vật tiềm năng

Trước khi đưa probiotic vào sử dụng, một bước rất cần thiết là cần phải xác định tính an tồn đới với vật chủ. Do đó, vật chủ được cảm nhiễm với các chủng probiotic đã chọn lọc ở các điều kiện bình thường hay điều kiện stress. Điều này được thực hiện bằng cách tiêm, tắm vật chủ trong dịch có chứa vi khuẩn probiotic hoặc bổ sung vào môi trường nuôi.

45

Giai đoạn này trong nghiên cứu có thể kết hợp với giai đoạn trước khi thử nghiệm quy mô nhỏ được tiến hành nhưng tốt hơn hết là thực hiện dưới điều kiện đơn vật chủ. Các nồng độ chất dinh dưỡng liên quan đến q trình ni vật chủ được xác định thơng qua q trình nghiên cứu và phát triển.

4.5. Đánh giá tác động trên mô hình thực nghiệm

Ảnh hưởng của các chủng probiotic tuyển chọn phải được kiểm tra trong điều kiện in vivo. Nếu probiotic tác động về phương diện dinh dưỡng thì probiotic tuyển chọn được bổ sung vào mơi trường ni và có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và/hay tỷ lệ sống. Tuy nhiên, quan tâm đến sự kiểm soát sinh học đới với hệ vi sinh vật thì thử nghiệm in vivo là một cơng cụ thích hợp để ước lượng ảnh hưởng của các chủng probiotic quan tâm lên vật chủ.

Cách thức ứng dụng của probiotic giả định

Các probiotic giả định được bổ sung vào vật chủ hoặc mơi trường xung quanh của nó theo nhiều phương án: (i) bở sung vào thức ăn nhân tạo, (ii) thêm vào môi trường nước nuôi (iii) tắm và (iv) thêm vào qua con đường thức ăn sống.

Gây nhiễm thực nghiệm – Thử nghiệm tính đối kháng in vivo

Bước quan trọng kế tiếp trong thử nghiệm cảm nhiễm in vivo liên quan đến gây nhiễm thực nghiệm với các bệnh đặc trưng. Các mầm bệnh hay các bênh cơ hội có thể được bở sung thông qua khẩu phần ăn (thức ăn sống hay nhân tạo), thông qua ngâm vật chủ trong môi trường chứa mầm bệnh, hay thông qua môi trường nước nuôi với cách thức thực hiện tương tự đối với probiotic.

Thử nghiệm gây nhiễm in vivo để phát hiện ảnh hưởng của probiotic nên được thực hiện với một sự cận trọng lớn. Những ảnh hưởng lâu dài nên được nghiên cứu để xác định mầm bệnh tiến triển như thế nào. Rất quan trọng để theo dõi quá trình tăng trưởng hay hoạt động của mầm bệnh ở vị trí mà sự trung hịa mầm bệnh của probiotic biểu hiện bị kìm hãm có thể đơn giản là do sự cạnh tranh về mặt dinh dưỡng.

4.6. Đánh giá hiệu quả kinh tế

Một yếu tố quyết định ứng dụng probiotic ở quy mơ lớn, đó là sự phát triển các cơng cụ kiểm tra để kiểm sốt việc sản xuất và ứng dụng việc nuôi cấy vi khuẩn. Việc sản xuất số lượng lớn sinh khối vi khuẩn yêu cầu việc kiểm sốt chất lượng thích hợp để tránh nhiễm các vi khuẩn khác. Cần phải quan tâm đến sự ởn định di truyền trong q trình sản xuất sinh khới vi khuẩn vì những đột biến tự nhiên hay kích thích có thể ảnh hưởng đến hoạt tính probiotic của các

46

chủng vi khuẩn. Việc kiểm tra được thực hiện với sự quản lý của sự nuôi cấy probiotic đến các lồi thủy sản ni trồng. Sự kiểm tra hệ vi sinh vật trong hệ thống nuôi trở thành một phần của kiểm tra định kỳ trong trang trại. Các cơng cụ phân tử thích hợp nhất với ứng dụng này.

Câu hỏi thảo luận:

1. Vai trò các loài vi khuẩn gram dương trong thành phần probiotic?

2. Các lồi vi khuẩn gram âm hữu ích có vai trò như thế nào trong thuỷ sản? 3. Ứng dụng nhóm bacteriophage trong thành phần probiotic như thế nào? 4. Nêu các bước chọn lọc dòng vi sinh vật hữu ích?

5. Nêu sự cần thiết của việc đánh giá khả năng gây bệnh của các dòng vi khuẩn tiềm năng?

6. Ví sao phải cần thiết đánh giá trên mơ hình thực nghiệm trước khi ứng dụng thực tế dòng vi khuẩn hữu ích?

47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Trần Cơng Bình, 2005. Bài giảng Vi sinh vật học ứng dụng trong thủy sản. Trương ĐH Cần Thơ.

2. Nguyễn Lân Dũng, 2003. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản giáo dục.

3. Nguyễn Văn Hoà, Phạm Hồng Sơn, 2007. Bài giảng vi sinh vật đại cương. Trường Đại Học Nông Lâm, Đại Học Huế.

4. Phạm Văn Kim. 2002. Giáo trình vi sinh vật đại cương. Trường ĐH Cần Thơ.

5. Biền Văn Minh, Kiều Hữu Ảnh, Phạm Văn Ty, Phạm Hồng Sơn, Phạm Thị Ngọc Lan và Nguyễn Thị Thu Thuỷ 2006, Giáo trình vi sinh vật học. NXB Đại học Huế.

6. Phạm Thị Tuyết Ngân, 2008. Bài giảng vi sinh vật hữu ích. Trường ĐH Cần Thơ.

7. Đặng Thị Hồng Oanh, 2005. Giáo trình vi sinh đại cương. Trường ĐH Cần Thơ.