• Phương pháp Chưng cất và trích ly đồng thời (SDE) • Phương pháp Chiết lỏng-lỏng (LLE)
• Phương pháp Chiết pha rắn (SPE)
• Phương pháp Chiết nhờ hấp phụ của thanh khuấy từ (SBSE)
2.3.1 Phương pháp Vi chiết pha rắn (Solid-phase microextraction -SPME) -SPME)
2.3.1.1 Giới thiệu [21,35,47,57]
SPME là một kĩ thuật làm tăng nồng độ các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi mà không cần sử dụng bất cứ một dung môi trích ly nào. Nguyên lý tách của kĩ thuật này là do sự phân bố của các cấu tử hữu cơ giữa pha lỏng (hay pha khí) và một pha là một lớp polymer mỏng (lớp này được phủ bên ngoài của cột silicagel trong thiết bị SPME).
Kĩ thuật này được phát minh bởi hai nhà khoa học Berlardi và Pawliszyn khi hai ông tiến hành phân tích các hợp chất hóa học trong môi trường. Càng về sau này, kĩ thuật trên được đánh giá là rất phù hợp để phân tích các cấu tử hương và các hợp chất dễ bay hơi.
Kĩ thuật SPME có thể được sử dụng để phân tích các cấu tử rất đa dạng trong cả thể rắn, lỏng và khí. Đây là kĩ thuật dựa trên nguyên lý cân bằng giữa hai pha, và để phân tích định lượng chính xác thì quá trình tách cấu tử từ pha này sang pha kia phải được điều khiển vô cùng nghiêm ngặt. Mỗi cấu tử cần phân tích đều có sự khác nhau về độ phân cực, độ bay hơi, hệ số phân bố trong pha nước và pha “dầu”, thể tích trong mẫu và trong không gian headspace, tốc độ dịch chuyển khi khuấy trộn...
Quá trình thực hiện kĩ thuật SPME không cần sự hỗ trợ của các dung môi hữu cơ và cũng cần không gia nhiệt mẫu nên sự hình thành các cấu tử thứ cấp không mong muốn cũng giảm đáng kể.
2.3.1.2 Thiết bị SPME [10,57]
Hình 2.13 dưới đây mô tả thiết bị SPME được sản xuất bởi công ty Supelco.
Ngày nay, người ta đã sản xuất các thiết bị có nguyên lý tương tự nhưng có thể tiến hành bơm mẫu tự động.
Hình 2.13: Cấu tạo thiết bị SPME [57]
Thiết bị có dạng một ống tiêm (syringe) có piston gắn lò xo và một bộ phận chứa (barrel) cho phép piston dịch chuyển, thay đổi vị trí trong quá trình tách cấu tử hay khi giải hấp phụ. Trong bộ phận chứa còn có một “kim tiêm” (needle) bằng thép không rỉ, và bên trong “kim tiêm” đó là một ống cũng bằng thép không rỉ được gắn
chặt với cột làm bằng silicagel. Phần dưới của cột được bọc bên ngoài bằng một lớp pha tĩnh. Pha tĩnh này chính là tác nhân hấp phụ để tách các cấu tử hương đi ra khỏi dung dịch ban đầu. Chức năng của “kim tiêm” là để đâm xuyên qua vách ngăn giữa bộ phận chứa mẫu và bộ phận tiêm mẫu vào thiết bị GC, đồng thời nó còn dùng để bảo vệ cột silicagel không bị vỡ trong khi lưu giữ và sử dụng.
Cột SPME thường được bao bên ngoài một lớp polymer có bề dày xác định, có thể là loại không phân cực như Polydimethyl Silosane (PDMS) hay phân cực hơn như Carbowax. Người ta có thể kết hợp các loại polymer với nhau (Carboxen, PDMS, carbowax, polymer của diphenylbenzen) để tạo ra các pha tĩnh có những đặc tính riêng dùng để tách các loại hợp chất dễ bay hơi đặc trưng.
Trong hầu hết các phép phân tích, người ta thường sử dụng PDMS có bề dày 100 µm. Nếu cần thiết phải đạt trạng thái cân bằng hấp phụ sớm hơn thì người ta có thể dùng pha tĩnh PDMS có bề dày nhỏ hơn (30µm), còn bề dày 7µm thích hợp với những mẫu chứa các cấu tử có nhiệt độ bay hơi cao hoặc khi cần phải giải hấp phụ ở nhiệt độ cao trước khi vào sắc kí khí. Pha tĩnh có có bề dày lớn hơn thích hợp với những hệ cần đạt cân bằng hấp phụ trong thời gian dài, nhưng những cột này sẽ nhạy hơn và hấp phụ được cả các cấu tử có khối lượng phân tử lớn.
2.3.1.3 Cơ chế thực hiện quá trình tách cấu tử của SPME [35,57,65,70]
Quá trình thực hiện tách các cấu tử hương dễ bay hơi được minh họa trong hình dưới đây:
Mẫu sẽ được chứa trong bộ phận chứa mẫu phù hợp. Trước khi tiến hành phân tích, cột phải được làm sạch bởi vì pha tĩnh có thể hấp phụ các chất trong không khí trước đó và sẽ tạo ra các peak lạ khi sắc kí.
• Nếu lấy mẫu trực tiếp, “kim tiêm” sẽ đâm xuyên qua vách ngăn và cột sẽ bị đẩy nhô ra ngoài “kim tiêm” và đi vào dung dịch mẫu. Các cấu tử hương sẽ hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh PDMS.
• Nếu tách chiết mẫu bằng nguyên lý headspace (headspace là phần không gian ngay trên mẫu trong bộ phận chứa mẫu), cột chỉ nhô ra ngoài “kim tiêm” nhưng không đi vào dung dịch mà chỉ nằm trong phần không gian ngay trên mẫu. Các cấu tử hương trong không gian headspace sẽ hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh.
Cả 2 cách lấy mẫu sẽ hiệu quả hơn nếu bổ sung một lượng muối ăn vào dung dịch trước khi lấy mẫu. Lượng muối này sẽ điều chỉnh lực ion trong dung dịch và do đó sẽ cải thiện trạng thái cân bằng hấp phụ. Có thể sử dụng thêm cánh khuấy để rút ngắn thời gian đạt trạng thái cân bằng.
Sau thời gian lấy mẫu thích hợp (từ 1-20 phút), cột sẽ được rút vào trong “kim tiêm” và “kim tiêm” sẽ được tháo tách rời khỏi vách ngăn và sẽ được gắn vào bộ phận bơm mẫu của thiết bị chạy sắc kí khí. Các cấu tử sẽ được giải hấp phụ bằng nhiệt nhờ nhiệt cung cấp từ bộ phận tiêm mẫu và sau đó sẽ được đưa vào cột sắc kí khí.
Vì SPME là kĩ thuật làm tăng nồng độ các cấu tử cần phân tích nên cần phải chỉnh tỉ lệ chia dòng ở bộ phận tiêm mẫu thấp hơn (10:1) để quá trình làm tăng nồng độ cấu tử không bị lãng phí. Phương pháp không chia dòng thường sẽ đưa nhiều cấu tử cần phân tích hơn vào cột và thường áp dụng cho những phương trường hợp cần độ nhạy cao.
Mỗi loại cột đều có mức độ phù hợp khác nhau đối với các cấu tử khác nhau. Nhìn chung thì cột với chất mang không phân cực sẽ thu hồi tốt các cấu tử hương hơn. Cột Polyacrylat sẽ nhạy khi phân tích cồn, phenol, aldehyde hơn là các ester và hydrocacbon.
Bảng 2.2: So sánh hiệu quả tách cấu tử hương trong mẫu chứa 10ppm bằng
phương pháp Headspace SPME của cột PDMS 100µm và cột Polyacrylat 85µm [57]
Cấu tử Cột PDMS Cột Polyacrylat Ethyl acetate n-Butanol Hexanal cis-3-Hexenol Benzaldehyde 4 1 54 6 22 3,1 3,3 48,1 19,5 59
Ethyl caproate Limonene Linalool Eugenol β-Ionone dimethyl sulfide Pyrrolidine Pyridine 320 1410 117 32 530 7 7 11 320 1410 117 32 530 6,3 7 3,7
Từ bảng trên, ta thấy cột Polyacrylat tách tốt các cấu tử có nhóm chức rượu (butanol, cis-3-hexenol, linalool), benzaldehyde, các hợp chất phenol như eugenol ; trong khi đó đối với các cấu tử thuộc nhóm ester (ethyl acetat, ethyl caproat),
hydrocacbon và pyridin thì khả năng tách kém hơn.
2.3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng trong SPME [35,36,57,70]
2.3.1.4.1 Pha tĩnh
Chất mang sử dụng làm chất hấp phụ trong cột SPME bao gồm một hoặc hai loại polymer (như PDMS, PA, carboxen-PDMS, PDMS-polydivinylbenzen, carbowax- DVB). Nguyên tắc làm giàu cấu tử như đã trình bày ở trên, đó là nguyên tắc hấp phụ.
Bề dày lớp chất mang PDMS thường là 7µm, 30µm, 100µm ; PA là 85µm; carboxen-PDMS là 75µm; PDMS-DVB là 65µm.
Yêu cầu của pha tĩnh:
• Độ phân cực của pha tĩnh phải gần với độ phân cực của cấu tử cần tách. • Pha tĩnh phải chịu được các điều kiện nhiệt độ cao, pH, muối...
PDMS là một trong các pha tĩnh không phân cực chịu được các điều kiện khắc nghiệt nhất và cột PDMS có khả năng hấp phụ và giải hấp phụ nhiều lần. Khi cần phân tích các cấu tử có độ phân cực thấp thì có thể sử dụng cột PA.
Bề dày của pha tĩnh của các loại pha tĩnh được đưa ra như trên là do tính toán dựa vào yêu cầu về độ nhạy và tốc độ hấp phụ:
• Bề dày 100µm thường được sử dụng khi cần độ nhạy cao và ít quan tâm đến thời gian,
• Bề dày 7µm sử dụng khi cần thời gian ngắn và không cần quá nhạy (trường hợp nồng độ cấu tử cần phân tích đủ cao).
Phương pháp Headspace (HS) thường được khuyến cáo sử dụng khi có thể vì khi đó sẽ làm giảm tải trọng của cột (không phải hấp thụ những chất cao phân tử như protein), vì vậy mà tuổi thọ của cột cũng cao hơn. Mặt khác, phương pháp HS cũng tránh được tính thuận nghịch trong hấp phụ nên tính chính xác cũng cao hơn. Các cấu tử có phân tử khối dưới 200, hay có cấu trúc không có những nhóm tạo liên kết hydro (-OH,-NH2...) rất phù hợp cho phương pháp HS vì chúng thường có áp suất hơi cao.
Phương pháp thực hiện SPME trực tiếp trong pha lỏng (direct SPME) thường sử dụng khi phương pháp HS cho các peak quá nhỏ.
2.3.1.4.3 Sự khuấy đảo
Thời gian để đạt trạng thái cân bằng hấp phụ sẽ rút ngắn nếu ta tiến hành khuấy mẫu. Các phương pháp khuấy thường sử dụng là khuấy từ, khuấy cơ học, khuấy nhờ vào chuyển động của cột SPME, hoặc khuấy nhờ siêu âm.
2.3.1.4.4 Thể tích mẫu (Vw) và thể tích phần HS (Vh)
• Với phương pháp Headspace SPME: Lượng cấu tử tách được sẽ càng nhiều khi Vw càng lớn (trong mức giới hạn), đồng thời Vh nên nhỏ đối với những cấu tử bay hơi tốt.
• Phương pháp Direct SPME: Vw không ảnh hưởng đến tốc độ tách cấu tử. Đến nay người ta vẫn chưa tìm hiểu được ảnh hưởng của Vw và Vh đến thời gian tách cấu tử. Tuy nhiên, các nhà khoa học khuyến cáo nên sử dụng Vh lớn hơn Vw
chừng 20 lần.
2.3.1.4.5 Thời gian tách cấu tử bằng hấp phụ (te)
Thời gian te được xác định từ khi đưa cột vào để hấp phụ cho đến khi không còn thấy peak nào xuất hiện thêm. Thời gian thí nghiệm càng gần với te thì càng tốt vì như thế thì sẽ giảm được những sai số trong quá trình thí nghiệm và khi đó độ nhạy sẽ là cực đại. te trong SPME thường ngắn hơn trong các phương pháp khác
2.3.1.4.6 Nhiệt độ
Theo nhiệt dộng học thì hằng số cân bằng Kfw (là tỉ lệ giữa nồng độ cân bằng của cấu tử trong cột hấp phụ và nồng độ cân bằng của cấu tử trong mẫu) giảm khi nhiệt độ giảm.
Nhiệt độ ảnh hưởng nhiều nhất đến phương pháp Direct SPME: hệ số khuếch tán càng tăng khi độ nhớt giảm (độ nhớt thấp khi nhiệt độ càng cao) nhưng khi đó thì độ nhạy sẽ giảm.
Với HS SPME, Kfh (hằng số cân bằng giữa pha tĩnh và headspace) và Khw (hằng số cân bằng giữa headspace và pha lỏng của mẫu) lần lượt sẽ tăng và giảm theo việc
tăng nhiệt độ. Và theo [70] , việc tăng nhiệt độ sẽ làm giảm tính nhạy của phương pháp tách SPME dựa vào cân bằng, tuy nhiên, tốc độ tách mẫu sẽ tăng. Khwcàng lớn thì các cấu tử có độ bay hơi thấp sẽ tách hiệu quả hơn. Ngoài ra, do việc truyền nhiệt kém trong HS nên nhiệt độ của cột hấp phụ sẽ thấp hơn nhiệt độ của mẫu nên lượng cấu tử cần tách sẽ hấp phụ chậm dần theo thời gian.
Nhìn chung, với mỗi dung dịch, cột hấp phụ và loại cấu tử cần tách, nhiệt độ tối thích thường được xác định bằng thực nghiệm.
2.3.1.4.7 Điều kiện giải hấp phụ
Thời gian giải hấp phụ càng ngắn càng tốt, vì vậy nhiệt độ cao nhất mà không làm phá hủy cột hấp phụ và các cấu tử phân tích thường được lựa chọn là nhiệt độ giải hấp phụ.
Với cột PDMS, nhiệt độ giải hấp phụ là 340oC (7µm), 280oC (30 và 100µm); cột PDMS-DVB thường là 270oC; cột PA thường là 320oC; cột carboxen-PDMS là 265oC. Các giá trị nhiệt độ này thu được chủ yếu là từ các kết quả thực nghiệm.
2.3.1.5 So sánh phương pháp SPME và phương pháp bơm mẫu trực tiếp
Để so sánh, ta thực hiện thí nghiệm sau: lấy 0,5ml dung dịch, giữ ổn định ở 55oC không khuấy đảo, không bổ sung muối. Sau một thời gian thích hợp để đạt trạng thái cân bằng lỏng khí, cột SPME được đưa vào để hấp phụ cấu tử đã bốc hơi trên bề mặt dung dịch trong 10 phút (phương pháp Headspace SPME) trước khi đem đi sắc kí khí với đầu dò FID. Diện tích peak mỗi cấu tử trong mỗi trường hợp được chuẩn hóa với n-butanol được trích từ cột PDMS. [57]
Bảng 2.2: So sánh diện tích peak của các phương pháp tách cấu tử hương [57]
Chất Bơm mẫu trực
tiếp
SPME lấy mẫu trực tiếp dạng dung dịch Headspace SPME Ethyl acetate Ethyl butyrate Limonene Ethyl caproate 3-Hexenyl acetate cis-3-Hexenol Benzaldehyde Linalool Diethyl succinate Neral 2-Methylbutyric acid 4,4 5,0 6.4 4.3 4.3 4.9 5.5 4.5 3.4 2.9 2.6 0,2 2,6 1.2 6.9 7.8 0.3 1.1 1.1 <0,1 7.0 0,1 1.2 11,5 2.6 8.4 12.0 2.1 6.0 6.0 <0,1 5.9 <0,1
Anethole Caproic acid Ethyl vanillin 4.8 3.2 3,3 14,1 0.1 <0,1 5,0 <0,1 <0,1
Từ bảng 2.2, ta thấy phương pháp SPME đều cho các diện tích peak nhỏ hơn phương pháp bơm mẫu trực tiếp. Điều này có thể giải thích là do quá trình hấp phụ chỉ tách được một phần các cấu tử cần phân tích. Do vậy, SPME không phát hiện ra các cấu tử có hàm lượng quá bé như diethyl succinate, acid Caproic, ethyl vanilin… và phương pháp tách chiết này thường được ứng dụng nhất khi phân tích các cấu tử có hàm lượng tương đối cao (C>0,1mg/L)
2.3.1.6 Ưu và nhược điểm của SPME [35,57,70] a. Ưu điểm
Các ưu điểm chính của SPME là không cần dùng dung môi trích ly, dễ thực hiện, cần ít thiết bị hơn các phương pháp khác, thời gian tiến hành ngắn, dễ tự động hóa, và có độ nhạy cao.
Phương pháp SPME có thể sử dụng để tách các cấu tử có độ bay hơi thấp lẫn các cấu tử có độ bay hơi cao.
b. Nhược điểm
Quá trình tách cấu tử của SPME diễn ra chậm hơn hẳn các phương pháp khác (Liquid-liquid extraction, Solid-phase extraction với cột nhồi).
Thời gian tách cấu tử chậm, lượng cấu tử tách được là nhỏ làm cho độ nhạy của một số cấu tử có hàm lượng thấp là không đạt yêu cầu.
Phương pháp tách trực tiếp (nhúng cột vào dung dịch) sẽ làm bẩn dung dịch cần phân tích.
Thời gian giải hấp phụ cũng lâu hơn các phương pháp khác (SPE). Thường thời gian giải hấp là 12-20 phút, và do đó thời gian sắc kí cũng dài hơn.
Cột hấp phụ sau mỗi lần sử dụng cần phải tốn thời gian để vệ sinh cột.
SPME chỉ thường được sử dụng để tách các cấu tử có hàm lượng tương đối cao, >0,1 mg/L.
Một nhược điểm ảnh hưởng lớn đến chi phí thực hiện đó là phương pháp trên chỉ thực hiện gián đoạn.
2.3.1.7 Ứng dụng trong định lượng cấu tử hương của dịch nho sau lên men. [47]
Phương pháp SPME đã được sử dụng rộng rãi trong định lượng các cấu tử hương trong dịch nước nho sau lên men, nhất là các cấu tử hương có hàm lượng cao
(>0,1mg/L) như ethyl acetat, methanol và các rượu bậc cao khác (butanol-1, butanol-2, 2-methyl butanol-1, 3-methyl butanol-1, isobutanol, 1-propanol).
Phần này sẽ trình bày việc định lượng cấu tử hương trong dịch nho sau lên men sử dụng phương pháp xử lý mẫu HS-SPME.
2.3.1.7.1 Nguyên liệu
Các chất sử dụng để nội chuẩn bao gồm ethyl acetat, methanol, butanol-2, propanol-1, isobutanol, butanol-1, 2-methyl butanol-1, 3-methyl butanol-1.
Các dung dịch chuẩn sau đều được chuẩn bị trong hỗn hợp ethanol- nước (13%) và được bảo quản ở 5oC:
• 1,32g/L ethyl acetat; 4g/L methanol
• 0,55g/L butanol-2 ;0,55g/L propanol-1; 0,88g/L isobutanol; 0,66g/L butanol-1 ; 1,10 g/L 2-methyl butanol-1; 3,30g/L 3- methyl butanol-1
Dung dịch để nội chuẩn gồm 4-methyl pentanol-2 (1,6g/L) ; 2-methyl-3-buten- 2-ol (28,8g/L); 2,3-butadione (56,0g/L) được pha trong ethanol.
Dung dịch A dùng để định tính và xác định tính khả thi của SPME: 11g/L acid tartaric, ethanol 13%, NaOH để chỉnh pH về 3,4. Lấy 4 ml dung dịch trên pha thêm 2,3 g NaCl, cho thêm 1ml các dung dịch chuẩn, 50µ l dung dịch nội chuẩn.
2.3.1.7.2 Cột hấp phụ
Có thể sử dụng các loại cột với các pha tĩnh khác nhau như: cột PDMS 100µm (PDMS-100), PDMS-7, Polydimethylsilosane-divinylbenzen 65µ m (PDMS-DVB), Polyacrylat 85µm (PA) và cột Carbowax- divinylbenzen 65µm (CW-DVB).