Các loại cám Tinh bột (mg/g) Glucose(mg/g) Protein(mg/g)
Khang dân 615,6 8,28 6,017
Hai dòng 603,1 8,34 6,078
Thiên ƣu 640,8 8,4 6,139
Từ bảng trên có thể thấy các loại cám khác nhau giá trị dinh dƣỡng cũng khác nhau. Để thủy phân cám gạo tạo ra maltose cần chọn loại cám gạo có giá trị tinh bột cao nhất để tạo ra nhiều maltose nhất. Vậy nên cám gạo đƣợc chọn cho quá trình thủy phân tinh bột tiếp theo là cám gạo Thiên Ƣu.
24
3.2 Kết quả xác định đặc tính của enzyme α - amylase
3.2.1 Xác định pH thích hợp để thủy phân cám gạo
Sau khi tiến hành thí nghiệm theo bố trí ở mục 2.4.2.2 thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Bảng 3.7 Kết quả xác định pH thích hợp pH 4 5 6 7 8 Hoạt độ α – amylase (u/ml) 14±0,4 16±0,5 22±0,8 17±0,5 15±0,3 Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy enzyme α – amylase có hoạt động tốt ở pH 5 -7. Tuy nhiên pH tối ƣu của enzyme là pH 6
3.2.3 Xác định nhiệt độ thích hợp của enzyme
Sau khi tiến hành thí nghiệm theo bố trí ở mục 2.4.2.3 thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.8 Kết quả xác định nhiệt độ thích hợp của enzyme
Nhiệt độ 30 40 50 60 70 80 90
Hoạt độ enzyme (u/ml)
20,2±0,3 21,92±0,6 20,0±0,4 19,5±0,3 19,3±0,3 19,0±0,5 17,3±0,4
Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy enzyme hoạt động mạnh mẽ ở nhiệt độ từ 30 C đến 80 C. Ở nhiệt độ 90 C enzyme vẫn hoạt động nhƣng giảm dần. Vậy nhiệt độ tối ƣu của enzyme là 40 C nhƣng enzyme là loại chịu nhiệt nên vẫn hoạt động tốt ở nhiệt độ cao.
3.3 Kết quả xác định điều kiện thủy phân cám gạo tạo maltose
3.3.1 Đường chuẩn maltose
Sau khi tiến hành thí nghiệm theo bố trí ở mục 2.4.4.1 thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.9
Bảng 3.9 Độ biến thiên mật độ quang theo mẫu đƣờng chuẩn maltose
Ống nghiệm 1 2 3 4 5
Glucose mg/ml (ml) 0 0.5 1 1.5 2
Nƣớc cất (ml) 10 9.5 9 8.5 8
Thuốc thử DNS (ml) 3 3 3 3 3
25
Hình 3.3 Đƣờng chuẩn maltose
3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân cám gạo
Trong điều kiện cơ chất thích hợp thì vận tốc phản ứng tuyến tính với nồng độ enzyme. Tuy nhiên khi nồng độ enzyme tăng đến một giới hạn thì tốc độ phản ứng khơng tăng lên nữa ( Nguyễn Trọng Cẩn, 1998). Giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất thừa vận tốc phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme. Càng về sau sản lƣợng tạo thành tăng lên, vừa đóng vai trị chất ức chế không cạnh tranh, vừa làm cơ chất trong môi trƣờng giảm nên khi tiếp tục tăng nồng độ enzyme thì vận tốc phản ứng tăng không đáng kể.
Nồng độ enzym là một yếu tố vô cùng quan trọng, ảnh hƣởng lớn tới quá trình thủy phân. Cần lƣu ý rằng, với yêu cầu thủy phân giới hạn để tạo ra maltose mong muốn, nên nồng độ enzym đƣợc sử dụng để thủy phân phải đảm bảo yêu cầu hoạt động tốt nhƣng không thủy phân hoàn toàn tinh bột ban đầu để tạo thành glucose.
Tiến hành thủy phân cám gạo với các thông số nhƣ sau: nồng độ cám gạo 20%, nhiệt độ 70C, thủy phân trong đệm pH 6.0. Quá trình thủy phân đƣợc thực hiện trong 10 phút có bổ sung amylase ở các nồng độ 0,25 – 1,0 U/g cám
y = 1,1704x + 1,2978 R² = 0,9948 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 0 0,5 1 1,5 2 2,5 OD
đường chuẩn maltose
Y-Values Linear (Y-Values)
26
gạo. Xác định hàm lƣợng maltose tạo thành bằng phƣơng pháp DNS. Kết quả đƣợc biểu diễn ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân cám gạo
Nồng độ amylase
(U/g) 0 0,25 0,5 0,75 1,0
Hàm lƣợng maltose
(mg/ml) 5.478 17.846 21.409 16.846 16.269
Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy, từ nồng độ 0,25 – 0,5 U/g, theo hàm lƣợng maltose trong dịch thủy phân tăng lên, sau đó giảm đi ở nồng độ enzyme 0,75 – 1,0 U/g. Có sự khác biệt này có thể do khi tăng nồng độ enzym, phản ứng tạo ra nhiều maltose hơn, tuy nhiên sau đó khi enzym cao quá sẽ tiếp tục thủy phân triệt để tinh bột thành glucose. Hàm lƣợng maltose đạt cao nhất 21.409 mg/ml ở nồng độ enzym 0,5 U/g.
3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân cám gạo
Với nồng độ cám gạo 20% khoảng nhiệt độ thủy phân đƣợc nghiên cứu là 30, 40, 50, 60, 70, 80 và 90C. Xác định hàm lƣợng đƣờng maltose bằng phƣơng pháp so màu DNS. Kết quả đƣợc biểu diễn trên bảng 3.11.
Bảng 3.11. ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân cám gạo
Nhiệt độ (oC) 30 40 50 60 70 80 90
Hàm lƣợng maltose (mg/ml)
17.230 18.66 19.70 20.52 21.71 21.12 19.58 Trong khi với khoảng nhiệt độ từ 30C - 70C, hàm lƣợng maltose thu đƣợc tăng dần và đạt cao nhất (21.71 mg/ml); ở mức 80 - 90C lƣợng maltose tạo ra ít hơn, chỉ đạt 19.58 mg/ml.
Vì vậy, ta lựa chọn nhiệt độ thủy phân là 70C cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân cám gạo
Thời gian thủy phân càng kéo dài thì phản ứng càng xảy ra triệt để và đạt thông số kỹ thuật cao (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv.,1998). Tuy nhiên với một lƣợng cơ chất nhất định, phản ứng thủy phân của enzyme đến một giai đoạn nào đó thì khả năng xúc tác sẽ giảm. Enzyme tạo ái lực với các sản phẩm tạo thành của phản ứng và cơ chất, các sản phẩm sinh ra đóng vai trị nhƣ chất kìm hãm
27
khơng cạnh tranh và kìm hãm hoạt động của enzyme (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv., 2004).
Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình thủy phân giới hạn cám gạo bằng enzym amylase đƣợc thực hiện trong điều kiện: nồng độ cám gạo 20%, nồng độ enzym 0,5 U/g pectin, thủy phân trong đệm pH 6.0, nhiệt độ 70C. Quá trình thủy phân đƣợc thực hiện với thời gian từ 10 - 60 phút. Xác định hàm lƣợng maltose tạo thành ở các mốc thời gian khác nhau, kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình thủy phân cám gạo
Thời gian (phút) 10 20 30 40 50 60 Hàm lƣợng maltose (mg/ml) 19.30 22.81 24.22 22.31 20.66 19.69
Theo kết quả trên, nhận thấy rằng, hàm lƣợng maltose tăng và đạt cao nhất là 24.22 mg/ml tại mốc 30 phút, sau đó giảm dần. Điều này có thể do thời gian càng dài, enzym thủy phân triệt để tạo thành glucose, nên lƣợng maltose tạo thành giảm dần. Do đó, lựa chọn thời gian thủy phân cho cám gạo nồng độ 20% (w/v) tạo maltose là 30 phút.
Từ phần 3.3 ta có thể thấy cám gạo đƣợc thủy phân tối ƣu nhất ở điều kiện nồng độ là 0.5 (u/g) trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ là 70 C.
3.4 Kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm
Tiến hành đánh giá các chỉ số vi sinh nhƣ mục 2.4.5. Kết quả kiểm tra vi sinh vật của sản phẩm maltose thủy phân từ cám gạo nhƣ sau
Bảng 3.13 Đánh giá các chỉ số vi sinh vật STT Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Giới hạn
cho phép Kết quả
1 Tổng số vi sinh vật hiều khí CFU/ml 104 10
2 Tổng Coliform CFU/ml 10 0
3 Tổng E. Coli CFU/ml Không có 0
5 Samonella CFU/25ml Khơng có 0
28
Dựa vào bảng kết quả đánh giá các chỉ số vi sinh vật ta thấy: sản phẩm dịch thủy phân cám gạo đạt yêu cầu theo TCVN 9974:2013, các chỉ tiêu nằm trong giới hạn cho phép của chỉ số vi sinh, do đó đảm bảo vệ sinh an tồn thực phẩm cho ngƣời sử dụng.
3.5 Định lƣợng maltose có trong mẫu
Hình 3.4: Sắc kí đƣờng khử đối chứng và mẫu dịch thủy phân
Chú thích:
G: glucose 10 mg/ml Mal: maltose 10 mg/ml
M1: dịch cám gạo chƣa thủy phân
M2: dịch cám gạo sau khi thủy phân 10 phút M3: dịch cám gạo sau khi thủy phân 20 phút M4: dịch cám gạo sau khi thủy phân 30 phút
Kết quả của bản sắc ký cho ta thấy trong dung dịch mẫu cám gạo ban đâu cũng đã có maltose nhƣng không nhiều. Sau khi thủy phân lƣợng maltose tăng lên thể hiện ở vết maltose đậm dần theo thời gian thủy phân. Dịch cám sau khi thủy phân vẫn lẫn nhiều glucose và tạp chất khác nhƣng lƣợng maltose cũng khá lớn.
29
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 4.1 Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu đƣợc các điều kiện thủy phân sản xuất maltose từ cám gạo bằng enzyme α – amylase đƣa ra các kết luận nhƣ sau:
Xác định đƣợc thành phần của 3 loại gạo
Đã xác minh đƣợc điều kiện tối ƣu hóa của q trình thủy phân cám gạo : ở pH 6,0, nhiệt độ 70 C, nồng độ enzyme/ cơ chất 0,5 (U/g) với thời gian thủy phân là 30 phút.
Dịch maltose thu đƣợc đạt chỉ tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm về các chỉ số vi sinh.
4.2 Kiến nghị
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên đề tài chƣa thực hiện đƣợc việc loại bỏ tạp chất để tạo thành maltose tinh sạch.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang và Trần Thị Luyến. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, 1998.
2. Dƣơng Thị Ngọc Hạnh và Nguyễn Minh Thủy. Sử dụng enzyme α – amylase trong thủy phân tinh bột từ gạo Huyết Rồng. Tạp chí khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ, 2014.
3. Trần Thị Nhung, Phạm Thị Thu Phƣơng, Nguyễn Thúy Hƣờng và Nguyễn Thị Mai Phƣơng, 2013. Nghiên cứu thu nhận Xylooligosaccharide (XOS) từ cám gạo bằng cơng nghệ enzyme. Tạp chí Sinh học, 35
4. Trần Ngọc Liên, Nguyễn Minh Thủy. Thu nhận dịch đƣờng glucose từ quá trình thủy phân cám gạo(giống IR5451) bằng phƣơng pháp enzyme. Tạp chí khoa học Trƣờng đại học Cần Thơ, 2016
5. Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Cƣờng, Nguyễn Ánh Nguyệt, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thủy Hƣơng, Phan Thụy Huyền. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2004.
6. Hoàng Hƣớng Quỳ, Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Minh Hạnh, Nguyễn Bích Liên, Mai Thu Hiền, Phan Mỹ Từ, Vũ Kim Dung và Đỗ Thị Loan. Nghiên cứu sản xuất đƣờng-mật tinh bột theo phƣơng pháp enzyme. Báo cáo khoa học mã số 18.01.04.07. Viện Công nghiệp Thực phẩm Hà Nội, 1986.
7. Hoàng Văn Tuấn, Phạm Hƣơng Sơn, Nguyễn Thị Hiền và Nguyễn Thị Lài. Nghiên cứu ảnh hƣởng của dịch chiết cám gạo đến hoạt tính của vi khuẩn Probiotics. Trung tâm Sinh học thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, 2013.
8. Tài liệu thực hành hóa sinh trao đổi chất. Viện công nghệ sinh học trƣờng đại học lâm nghiệp Việt Nam.
TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI
1. Bijttebier, A., Goesaert, H. and Delcour, J. A.. Amylase action pattern on starch polymers. Biologia 63/6: 989-999, 2008 Section Cellular and Molecular Biology, 2008.
2. D. S. Young and Agathe J. Jackson. Thin – Layer Chromatography of Urinary Carbohydrater. Clinical Chemistry, Vol.16, No.11, 1970.
3. Hernandez, N., Rodriguez-Alegrisa, M.E., Gonzalez, F. and lopez- Munguia, A. Enzymatic treatment of rice bran to improve processing. Journal of the American Oil Chemists’Society, Springer Berlin. Volume 77. Number 2. p. 177-180., 2000
4. Keharom, S., Mahachai, R. and Chanthai, S. The optimization study of α – amylase activity based on central composite design – response surface methodology by dinitrosalicylic acid method. International Food Research Journal 23(1); 10-17, 2016.
5. Kunamneni, A. and Singh, S., 2005. Response surface optimization of enzymatic hydrolysis of maize starch for higher glucose production. Biochemical Engineering Journal, 27(2), 179-190.
6. Marc J.E.C. van der Maarel, Bart van der Veen, Joost C.M. Uitdehaag, Hans Leemhuis, L.Dijkhuizen. Properties and applications of starch – converting enzymes of the α – amylase family. Journal of Biotechnology 94, 2002.
7. Miller, G. L., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing sugar. Analytical Chemistry, Vol.31, No. 3. (1 March 1959), pp. 426-428.
8. Sfalcin, P.,Lunelli, F. C., Maleski, T. P. S, Foletto, V. S., Souza, M., Dal Pra, V., Kuhn, R. C. and Maz, M. A. Glucose obtained from rice bran by ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis. Ing. Investig. vol.35, n.2, pp.61-66., 2015