Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết DNA từ các loại mẫu bệnh phẩm khác nhau.

viêm ruột hoại tử ở gà và lợn.

- Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi của các cặp mồi được sử dụng trong đề tài nghiên cứu.

- Xác nhận sự hiện diện của các tác nhân gây bệnh trong các mẫu bệnh phẩm tương ứng.

2.4. Mẫu bệnh phẩm, hóa chất và các trang thiết bị sử dụng nghiên cứu

2.4.1. Mẫu bệnh phẩm

Sử dụng mẫu máu, mẫu mô, và mẫu phân từ các đối tượng gà và lợn được chẩn đoán nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử.

2.4.2. Hóa chất thí nghiệm

- Bộ Kit “G-spinTM Total DNA

Extraction Kit”

- NaCl bão hòa

- Nitơ lỏng - Tris-HCl

- Cồn 70o, cồn 100o - EDTA - Proteinase K, RNase - SDS 20%

- PCR Master Mix 2X - Nucleic acid Loading dye 6X - H2O đề ion (dH2O) - TAE 50X

- Redsafe - Agarose

- dNTPs - MgCl2

2.4.3. Trang thiết bị nghiên cứu

Sử dụng các máy móc, thiết bị của phịng thí nghiệm cơng nghệ gen, Viện CNSH Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp. Các thiết bị bao gồm: tủ an toàn sinh học cấp 2, nồi hấp khử trùng, bể ổn nhiệt, lị vi sóng, máy vortex, máy ly tâm lạnh, máy PCR, máy điện di, máy soi gel, cân điện tử, tủ lạnh và tủ lạnh sâu.

2.4.4. Dụng cụ thí nghiệm

- Pipet và pipet tips - Chai, lọ thủy tinh;

PCR 0.2ml;

- Ống đong; - Bộ cối chày sứ; - Dao, kẹp.

2.5. Phương pháp nghiên cứu

2.5.1. Thu nhận, bảo quản mẫu bệnh phẩm

- Thu nhận mẫu:

 Mẫu máu: có thể thu nhận bằng cách cắt tiết gà hoặc lấy máu từ vùng tĩnh mạch dưới cánh gà bằng kim tiêm.

 Mẫu mô: thu nhận các mẫu nội tạng nếu quan sát thấy vết bệnh tích có trên nội tạng tương ứng với chẩn đoán lâm sàng.

 Mẫu phân : phân được lấy bằng tăm bông tiệt trùng. - Bảo quản mẫu:

 Các ống chứa chất chống đông (EDTA) được dùng để chứa và bảo quản các mẫu máu.

 Các ống chứa cồn tuyệt đối được dùng bảo quản mẫu ruột.

 Các mẫu bệnh phẩm được bảo quản trong một thùng nhựa giữ nhiệt chứa đá khơ tạo mơi trường thích hợp để ức chế sự hoạt động của các enzyme có sẵn trong mẫu bệnh phẩm. Các mẫu bệnh phẩm sau đó được bảo quản trong tủ lạnh 4oC cho đến khi sử dụng.

2.5.2. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm

Mẫu máu và ruột đều được tách chiết theo các bước do nhà sản xuất cung cấp của bộ Kit “G-spinTM Total DNA Extraction Kit” InTRON - Hàn Quốc. Bộ Kit được thiết lập dựa trên phương pháp tách chiết DNA bằng cột

Silica (kỹ thuật tách chiết DNA pha rắn/lỏng), đây được xem như là phương pháp sử dụng rộng rãi nhất trong các phịng thí nghiệm do tiết kiệm được thời gian thí nghiệm và năng suất tách chiết DNA cao (geneticeducation.co.in).

2.5.3. Kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR được thực hiện để nhân bản các đoạn gen mục tiêu với thành phần phản ứng như bảng 2.1.

Các cặp mồi được sử dụng trong đề tài được mô tả như trong bảng 2.2. Thể tích hỡn hợp mỡi phản ứng PCR là 20l, trong đó chứa các thành phần và nồng độ các chất tham gia phản ứng như trên. Chu kỳ nhiệt cho PCR: 950C trong 5 phút; (950C: 30 giây, tiến hành thí nghiệm gradient PCR với dải nhiệt độ 500C - 600C: 30 giây, 720C: 1 phút) lặp lại 35 chu kỳ; 720C trong 10 phút; bảo quản sản phẩm PCR ở 40C. Được mô tả qua bảng 2.3.

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR Hóa chất Nồng độ Thể tích (µ) Hóa chất Nồng độ Thể tích (µ) PCR Master Mix 2x Đệm 2X 10 dNTPs 2mM

Taq DNA polymerase 5U

Mồi xi/ngược 10µM 1

DNA khuôn 20-50ng 1

Nước deion 8

Tổng 20

Bảng 2.2: Mồi sử dụng trong đề tài

Tên mồi Trình tự 5’ – 3’ Tỉ lệ G-C % Tm oC Kích thước mồi (bp) Kích thước đoạn khuếch đại (bp) Nguồn 16S_F AAAGATGGCATCATCA TTCAAC 36 55 22 279 Rong-Fu Wang và cộng sự (1994) 16S_R TACCGTCATTATCTTC CCCAAA 41 55 22

Bảng 2.3 : Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Các bước Số chu kì Nhiệt độ (oC) Thời gian

Khởi động 1 95oC 5 phút Tách mạch 35 95oC 30 giây Gắn mồi 500C - 600C 30 giây Kéo dài 72oC 1 phút Ổn định 1 72oC 10 phút Bảo quản 4oC ∞ 2.5.4. Kỹ thuật điện di Chuẩn bị dung dịch đệm

Công thức: 980mL nước cất + 20mL TAE 50X tạo thành 1L dung dịch đệm TAE 1X, tương ứng với pha loãng 50 lần dung dịch TAE 50X.

Sử dụng dung dịch đệm TAE 1X để pha gel agarose.

Chuẩn bị gel điện di

Pha 50ml gel agarose với nồng độ 1% agarose, đong 50ml TAE 1X và thêm 0.5g agarose, lắc nhẹ và đồng nhất dung dịch bằng lị vi sóng. Quan sát nếu thấy agarose tan hồn tồn, để nguội đến khoảng 60oC thì bổ sung thuốc nhuộm axit nucleic Redsafe, lắc nhẹ cho tan Redsafe rồi đổ ra bảng gel đã được cài lược sẵn, chờ gel đặc lại ở nhiệt độ phịng.

Với bản gel khơng sử dụng Redsafe, mix các mẫu DNA đã được PCR với dye đã liên kết ethidium bromide.

Hiệu chỉnh thông số

Thiết lập hiệu điện thế, phổ từ 60 – 80V, thời gian từ 30 phút đến 1h, nếu hiệu điện thế quá cao sẽ sinh ra lượng lớn nhiệt và làm ảnh hưởng đến quá trình di chuyển của DNA, còn ở hiệu điện thế thấp sẽ kéo dài thời gian điện di.

Thu nhận và xử lý số liệu

Kết quả điện di được quan sát dưới tia UV, nếu xuất hiện băng vạch DNA thì sẽ hiện lên màu hồng cam và kích thước tương đối của các băng vạch sẽ được tính tốn dựa trên marker DNA 100bp.

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA

Đối với những bệnh truyền nhiễm ở gia súc, gia cầm thì trước khi tiến hành lấy mẫu để tách chiết DNA chúng ta phải có thơng tin về loại tác nhân gây bệnh, cơ quan và mô nơi tác nhân gây bệnh ký sinh. Từ đó, chúng ta đưa ra quyết định sẽ thu loại mẫu bệnh phẩm nào để tách chiết được axit nucleic (DNA, RNA) phục vụ cho việc phát hiện bệnh bằng phương pháp PCR. Cụ thể, với tác nhân gây bệnh là virus thì có thể thu dịch cơ thể và mơ để tách chiết axit nucleic, vi khuẩn thì có thể thu dịch cơ thể, mơ, và ký sinh trùng có thể thu dịch cơ thể, mô, phân.

3.1.1. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm của lợn

Hình 3.1: Kết quả kiểm tra DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm

khác nhau của lợn chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử trên gel agarose 1%. Trong đó, mẫu máu (giếng 1), mẫu phân ( giếng 2), mẫu ruột (giếng 3) của

lợn chẩn đốn bệnh viêm ruột hoại tử

Hình 3.1 là kết quả tách chiết DNA tổng số từ 03 mẫu bệnh phẩm của lợn được chẩn đoán mắc bệnh viêm ruột hoại tử. DNA tách từ mẫu máu (Giếng 1, Hình 3.1) và mẫu ruột (Giếng 3, Hình 3.1) có chất lượng tương đối tốt, hàm lượng DNA không nhiều nhưng đủ tiêu chuẩn để làm khuôn cho phản ứng

PCR. Riêng DNA tách từ mẫu phân (Giếng 2, Hình 3.1) thì gần như khơng quan sát thấy băng sáng tuy nhiên sản phẩm tách DNA vẫn được sử dụng để tiến hành phản ứng PCR vì PCR là một kỹ thuật rất nhạy chỉ cần một lượng nhỏ DNA khn đã có thể nhân bản được đoạn gen mong muốn.

3.1.2. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm của gà

DNA được tách chiết từ mẫu máu sử dụng kit tách chiết “G-spinTM Total DNA Extraction Kit” và theo hướng dẫn sử dụng. Kết quả tách chiết DNA từ 06

mẫu máu bệnh phẩm được thể hiện trong hình 3.2. Trong đó, 04 mẫu máu được chẩn đốn bệnh viêm ruột hoại tử có chất lượng và hàm lượng DNA rất khác nhau (Hình 3.2A). Cụ thể, mẫu số 01 có hàm lượng DNA lớn nhất so với các mẫu còn lại và chất lượng DNA tương đối tốt thể hiện bằng một vạch sáng rộng và dải smear (tạo thành do DNA bị đứt gãy thành các đoạn nhỏ) rất ngắn ngay bên dưới vạch DNA (Giếng 1, Hình 3.2A). Mẫu 02 và 03 có hàm lượng DNA thấp hơn hẳn so với mẫu 01, nhưng chất lượng DNA cũng tương đối tốt (Giếng 2, 3; Hình 3.2A). Riêng mẫu số 04 gần như khơng nhìn thấy vạch sáng của DNA, điều này cho thấy hiệu quả tách chiết DNA từ mẫu này chưa tốt (Giếng 4; Hình 3.2A) và mẫu này khơng được sử dụng cho bước nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.2: Kết quả kiểm tra DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu bệnh

phẩm khác nhau của gà chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử

Kết quả tách chiết DNA tổng số từ 02 mẫu bệnh phẩm ruột Gà được thể hiện ở Hình 3.2B. Trong đó, mẫu số 01 có hàm lượng DNA tương đối lớn nhưng DNA bị đứt gãy thể hiện ở dải smear kéo dài xuống phía dưới (Giếng 1, Hình 3.2.B). Sự đứt gãy DNA có thể là do q trình nghiền mẫu trong nitơ lỏng với lực mạnh và trong thời gian nghiền thì mẫu khơng hồn tồn được bảo quản lạnh trong nitơ, mà vẫn có thời điểm mẫu nghiền hết nitơ tạo điều kiện enzyme DNase trong tế bào hoạt động cắt một phần DNA tổng số thành những đoạn ngắn. Với hàm lượng DNA lớn như mẫu 01 thì cần pha lỗng ít nhất 50 lần để đạt được hàm lượng DNA thích hợp cho tiến hành phản ứng PCR. Mẫu 02 không xuất hiện vạch DNA (Giếng 2, Hình 3.2.B), điều này cho thấy hiệu quả tách chiết DNA của mẫu 02 không đạt và mẫu này cũng không được sử dụng cho bước nghiên cứu tiếp theo. Nguyên nhân có thể là do nhầm lẫn giữa cột chứa dung dịch có DNA và ống ly tâm 2.0ml khơng chứa DNA. Vì vậy, khi tách chiết DNA người làm thí nghiệm cần phải tập trung và cẩn thận với từng bước trong q trình làm thí nghiệm, tránh chủ quan dẫn đến những sai sót.

3.2. Kết quả phát hiện bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn

Tiểu đơn vị nhỏ 16S - rRNA là một trong hai tiểu phần quan trọng cấu thành nên ribosome của vi khuẩn, chúng là rất ngắn (chỉ 1.542 nucleotide). Với vai trò quan trọng trong việc dịch mã và tổng hợp nên protein của ribosome thì tính bảo thủ của nó của các lồi trong sinh giới rất cao, do hầu hết các lồi cịn tồn tại đến nay đều là hậu duệ của các loài tổ tiên từ hơn 3,5 tỷ năm trước (Campbel và cộng sự, 2008). Tuy nhiên, gen 16S - rRNA từ vi khuẩn khác nhau sẽ có một vài nucleotide khác nhau nằm rải rác trong các trình tự, dựa vào những sai khác đó mà gen 16S-rRNA thường được sử dụng để phân biệt các loài.

Bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn do loài vi khuẩn C. perfringens gây nên. Chủng vi khuẩn C. perfringens hiện diện ở các cơ quan tiêu hóa, trong đó chủ

để thiết kế mồi nhằm phát hiện tác nhân gây bệnh là C. perfringens trong các mẫu bệnh phẩm thu được từ các cá thể lợn đã được chẩn đoán lâm sàng. Cặp mồi 16S_F/R được sử dụng trong nghiên cứu này chỉ bắt cặp bổ sung với một đoạn trong gen mã hóa cho 16S - rRNA của C. perfringens (Wang và cộng sự, 1994). Cặp mồi này sẽ khuếch đại một đoạn DNA có kích thước 279bp và chỉ đặc hiệu đối với loài C. perfringens. Wang và cộng sự (1994) công bố nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi này là 55oC, từ tham khảo đó chúng tơi chọn dải nhiệt độ là 50oC, 52oC, 55oC, 58oC, và 60oC để thực hiện phản ứng PCR gradient nhằm tìm ra nhiệt độ gắn mồi tối ưu nhất.

Đối với DNA được tách từ mẫu máu và ruột của lợn không xuất hiện sản phẩm PCR ở tất cả các nhiệt độ. Mẫu phân tuy hàm lượng DNA tổng số rất ít, khơng nhìn thấy trên ảnh điện di khi kiểm tra DNA tổng số (Giếng 2, Hình 3.1) thì xuất hiện sản phẩm PCR ở cả bốn nhiệt độ là 52oC, 55oC, 58oC, 60oC, chỉ riêng ở nhiệt độ 50oC thì khơng xuất hiện sản phẩm PCR (Hình 3.3). Dựa vào độ sáng của băng sản phẩm PCR trên hình 3.3 cho thấy nhiệt độ gắn mồi thích hợp nhất của cặp mồi 16S_F/R là 60oC.

Hình 3.3: Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi 16S_F/R trên mẫu

DNA tách từ phân của Heo chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử

3), 580C (giếng 4), 600C (giếng 5), M: ADN Marker 100bp.

Hình 3.4: Kết quả PCR với cặp mồi 16S_F/R

Trong đó: giếng 1 –mẫu máu ; giếng 2 – mẫu phân; giếng 3 – mẫu ruột, giếng 4 – đối chứng âm không bổ sung DNA khuôn mà thay bằng nước, M: marker 100bp.

Trong thí nghiệm tiếp theo cặp mồi 16S_F/R được sử dụng để nhân bản đoạn gen 16S-rRNA trong 03 mẫu bệnh phẩm của lợn (mẫu máu, ruột và

phân). Kết quả trên hình 3.4 chỉ ra rằng chỉ có mẫu phân cho kết quả dương tính với một băng DNA đặc hiệu với kích thước gần 300 bp như kích thước dự kiến (Giếng 2, Hình 3.4), cịn mẫu từ máu và ruột thì khơng xuất hiện băng sản phẩm PCR. Với kết quả này, chúng tơi có thể khẳng định mẫu phân lợn sử dụng trong nghiên cứu có nhiễm vi khuẩn C. perfringens. Hai mẫu cịn lại là máu và ruột, tuy lấy trên cùng một con lợn nhưng lại không xuất hiện băng DNA đặc hiệu có thể là do lợn mới nhiễm khuẩn và vi khuẩn chưa xâm nhiễm vào trong máu và ruột. Một điều quan trọng là mẫu DNA tách từ phân gần như không xuất hiện khi điện di trên gel agarose 1% nhưng kết quả PCR lại khẳng định là có DNA trong mẫu tách chiết nhưng với hàm lượng quá nhỏ. Tuy nhiên, hàm lượng DNA này vẫn đủ để làm khuôn cho phản ứng PCR nhân bản thành công đoạn gen 16S-rRNA của vi khuẩn C. perfringens.

3.2. Kết quả phát hiện bệnh viêm ruột hoại tử ở gà

Bệnh viêm ruột hoại tử ở gà cũng do chủng vi khuẩn C. perfringens gây nên. Do đó, cặp mồi 16S_F/R vẫn được sử dụng để phát hiện bệnh viêm ruột hoại tử trên gà. Nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi 16_F/R đã được tối ưu ở thí nghiệm trên là 60oC. Phản ứng PCR được thực hiện đối với 03 mẫu DNA tách từ máu và 01 mẫu DNA tách từ ruột. Kết quả của phản ứng PCR được thể hiện trên hình 3.5.

Hình 3.5: Kết quả nhân bản đoạn gen 16S-rRNA của vi khuẩn C. perfringens

từ các mẫu bệnh phẩm của gà

Giếng 1: Đối chứng âm (không bổ sung DNA khuôn mà thay bằng H2O); giếng 2: mẫu ruột 01; giếng 3-5: mẫu máu 01-03; M: DNA marker 1 kb.

Trong tổng số 04 mẫu DNA tách chiết lần lượt từ 01 mẫu ruột và 03 mẫu máu của gà thì chỉ có mẫu ruột là cho kết quả dương tính với cặp mồi 16S_F/R. Sản phẩm PCR từ mẫu ruột có kích thước 279bp như dự kiến với một băng DNA đặc hiệu duy nhất (Giếng 2, Hình 3.5). Kích thước đoạn DNA được khuếch đại sử dụng cặp mồi 16S_F/R ở nhiệt độ gắn mồi 60oC thu được từ mẫu ruột tương đồng với kết quả của Rong-Fu Wang và cộng sự (1994). Điều này khẳng định việc sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện bệnh

viêm ruột hoại tử ở gà là rất khả thi và loài C. perfringens là tác nhân gây bệnh trên mẫu gà nghiên cứu. Tuy nhiên, mẫu DNA từ máu lại không xuất hiện băng DNA như dự kiến (Giếng 3, 4, 5; Hình 3.5). Mẫu DNA tách từ máu không xuất hiện sản phẩm PCR đặc hiệu có thể do các mẫu bệnh phẩm đó khơng chứa DNA của lồi vi khuẩn C. perfringens .

Nguyên nhân có thể là do tác nhân gây bệnh chưa xâm nhiễm vào hệ thống máu. Hoặc có thể là do quá trình sinh sản vơ tính của C. perfringens bị bất

hoạt bởi các thuốc kháng sinh được sử dụng điều trị cho gà nên ở các mẫu máu khơng cịn tồn tại tác nhân gây bệnh. Bên cạnh đó, khả năng tồn tại của

C. perfringens trong máu có thể là rất thấp, vi khuẩn C. perfringens là một