26
Bảng 3. 3 Ảnh hưởng của BA lên khả năng bật chồi từ mơ sẹo có nguồn gốc từ mơi
trường bổ sung các nồng độ 2,4D khác nhau của cây cơm cháy sau 8 tuần nuôi cấy
Nồng độ 2,4D (mg/l) từ thí nghiệm 2 Nồng độ BA (mg/l) Tỷ lệ mẫu sẹo sống (%) Chất lượng sẹo (%) Yếu Bình thường Mạnh 0,5 0,5 95 11 17 72 1 100 27 33 40 1,5 100 27 21 52 2 100 46 14 40 2,5 88 53 30 17 1 0,5 97 36 46 18 1 98 12 49 39 1,5 98 17 39 44 2 92 26 39 35 1,5 90 50 29 21 1,5 0,5 100 41 29 29 1 100 40 43 17 1,5 98 35 40 25 2 100 38 58 4 2,5 100 59 34 7 2 0,5 100 66 31 3 1 100 66 25 9 1,5 100 50 41 9 2 100 58 32 10 2,5 100 72 21 8 2,5 0,5 100 77 23 0 1 97 67 33 0 1,5 100 75 22 3 2 98 77 21 2 2,5 100 65 30 5
27
Kết quả thu được từ thí nghiệm trên cho thấy:
- Dãy nồng độ BA khảo sát trên chưa thích hợp cho việc bật chồi từ mơ sẹo. - Mơ sẹo có nguồn gốc từ môi trường bổ sung 0,5 mg/l 2,4D được nuôi cấy trên môi trường chứa 0,5 mg/ml BA là cho kết quả cảm ứng tăng sinh mô sẹo tốt nhất với 72% mô sẹo cảm ứng mạnh và chỉ 11% mô sẹo yếu.
- Khi so sánh giữa các nghiệm thức cho thấy có sự tương quan giữa nồng độ của 2,4D trong giai đoạn tạo mô sẹo với nồng độ BA ở giai đoạn bật chồi. Ví dụ, mẫu tăng sinh tốt nhất trên mơi trường bổ sung 1 mg/l BA là mơ sẹo có nguồn gốc từ mơi trường chứa 1 mg/l 2,4D (và kết quả tương tự cũng được ghi nhận ở các dải nồng độ khác).
- Các khối mơ sẹo có nguồn gốc từ cùng một nồng độ 2,4D cho phản ứng tăng sinh mô sẹo giảm dần khi gia tăng nồng độ BA. Ví dụ mơ sẹo có nguồn gốc từ mơi trường chứa 0,5 mg/l 2,4D cho kết quả tăng sinh tốt nhất ở nồng độ 0,5 mg/l BA với tỷ lệ 72% và giảm dần và chỉ còn đạt 40% ở nồng độ 2,0 mg/l BA; 17% ở nồng độ 2,5 mg/l BA.
- Trong cùng một môi trường bổ sung nồng độ BA như nhau thì mơ sẹo có nguồn gốc từ mơi trường có chứa 2,4D với nồng độ càng cao thì sự phát triển của mơ sẹo càng yếu. Như ở nồng độ 1,0 mg/l BA tỷ lệ mô sẹo tăng sinh mạnh giảm dần khi nồng độ 2,4D tăng lên, đạt tỷ lệ cao nhất là ở nồng độ 0,5 mg/l 2,4D là 40% và giảm dần còn 9% ở nồng độ 2,0 mg/l 2,4D và ở nồng độ 2,5 mg/l 2,4D thì khơng cịn khả năng tăng sinh tốt nữa.
Như vậy, có sự tương tác rõ rệt giữa 2,4D trong giai đoạn cảm ứng tạo mô sẹo và BA trong giai đoạn bật chồi.
Khi bổ sung cytoinin ngoại sinh vào môi trường nuôi cấy sự thay đổi gradient nồng độ chất điều hòa sinh trưởng diễn ra đồng thời thiết lập một gradient nồng độ chất điều hòa sinh trưởng mới. Điều này giúp phá vỡ trạng thái ngủ và kích thích sự phát triển chồi (Ngơ Thị Xun và cs., 2018). Như đã được chứng minh trước đó cytokinin có tác dụng kích thích sự hình thành phơi vơ tính từ ni cấy mơ sẹo khơng có khả năng phát sinh phơi được báo cáo trên các lồi cây đậu như Phaseolus (Malik và Saxena, 1992), Trifolium (Maheshwaran và Williams, 1986), cây đậu phộng (Gill và Saxena, 1992). Tỷ lệ nồng độ giữa auxin và cytokinin đóng một vai trị quyết định trong việc điều chỉnh cảm ứng hình thành mơ sẹo thực vật (Ikeuchi và cs., 2013). Khi tỷ lệ giữa hàm lượng auxin và cytokinin (nội sinh, ngoại sinh) cân bằng sẽ kích thích cảm ứng hình thành mơ sẹo (Domagalska và cs, 2011). Việc sử dụng nguồn mẫu là lá non giúp cho q trình biệt hóa trở nên thuận lợi hơn khi các tế bào cịn non dễ xảy ra q trình phản biệt hóa để tạo thành mô sẹo, đồng thời các mẫu lá có chứa gân lá là bộ phận giúp vận chuyển các chất dinh dưỡng cũng như các chất điều hòa sinh trưởng đến các cơ quan thông qua
28
hệ thống mạch dẫn; lá non cịn là nơi có thể sản sinh và tổng hợp auxin giúp cho quá trình tạo mô sẹo thuận lợi hơn.
Bên cạnh việc đánh giá dựa trên hình thái bên ngồi và mức độ cảm ứng của mơ sẹo, khối mô sẹo được giải phẫu và quan sát dưới kính hiển vi cho thấy mơ sẹo gồm nhiều lớp tế bào hình cầu mọng nước, xốp nhưng vẫn khơng có khả năng bật chồi (có thể là nồng độ BA bổ sung vào mơi trường ni cấy chưa thích hợp). Lúc đầu khối mơ sẹo là các tế bào có màu xanh nhưng khi khơng có khả năng bật chồi thì các tế bào đó chỉ tiếp tục nhân lên, tạo ra các tế bào chưa biệt hóa và chức năng của các tế bào bị giảm dần. Khơng cịn sự xuất hiện của diệp lục, các tế bào dần chuyển sang màu trắng, qua một thời gian thì chuyển sang màu nâu, khơng còn khả năng phát triển, các tế bào chết dần và chết từ ngoài vào trong (càng ở ngồi thì màu càng đậm). Hiện tượng chết dần mẫu từ ngồi vào trong có thể là dokhối mơ sẹo càng lớn thì khả năng vận chuyển các chất dinh dưỡng từ môi trường đến các tế bào càng hạn chế do trong mơ sẹo khơng có mạch dẫn. Vì vậy, khối tế bào bên ngoài sẽ thiếu chất dinh dưỡng và chết dần đi.
Từ kết quả mà chúng tơi thu được từ thí nghiệm trên, chúng tơi đưa ra được một vài kết luận của thí nghiệm này:
- Nồng độ BA khảo sát chưa thích hợp cho việc bật chồi từ mơ sẹo.
- Nồng độ 0,5 mg/l 2,4D chuyển sang môi trường 0,5mg/l BA cho tỷ lệ mô sẹo tăng sinh mạnh cao nhất (72%).
- Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng cao làm giảm khả năng tăng sinh của mô sẹo. - Tỷ lệ tăng sinh và còn sống sau 8 tuần của mô sẹo đạt trên 90% ở tất cả các nghiệm
29
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận 4.1. Kết luận
Qua kết quả thu được từ các thí nghiệm trên chúng tơi đưa ra một số kết luận rằng:
- Sử dụng NaClO 1% (20 phút) để khử trùng mẫu lá cây cơm cháy cho kết quả tốt nhất để tạo nguồn mẫu cấy vơ trùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Mơi trường MS có bổ sung 2,4D là phù hợp cho việc nuôi cấy tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây cơm cháy.
- Dãy nồng độ BA sử dụng để khảo sát trong thí nghiệm trên chưa phù hợp cho cảm ứng bật chồi ở mẫu cơm cháy.
4.2. Kiến nghị
Vì hạn chế về mặt thời gian, nên chúng tơi chưa thực hiện được q trình nhân chồi từ mơ sẹo của cây cơm cháy một cách hồn chỉnh, vì vậy chúng tơi có một số kiến nghị sau:
- Khảo sát môi trường dinh dưỡng thích hợp lên khả năng bật chồi từ khối mô sẹo cây S. javanica Blume.
- Cấy chuyển mơ sẹo có nguồn gốc từ mơi trường bổ sung 2,4D sang môi trường MS để làm giảm nồng độ 2,4D trong khối mô sẹo trước khi cấy chuyển sang mơi trường có BA để bật chồi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo trong nước
1. Bùi, V. T. V., Vũ, T. T., Thái, T. H., Đỗ, K. T., & Dương, T. N. (2014). Nghiên cứu hình thái giải phẫu và cấu trúc phơi trong q trình phát sinh phơi vơ tính Sâm Ngọc
2. Hằng, N. T. (2004). “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của chi Sambucus L. ở Việt Nam”. Luận án
tiến sỹ, Đại học Y Hà Nội.
3. Hằng, N. T., Kỳ, P. T. & Hiền, T. V. (1998). “Thăm dị tác dụng
chống oxi hóa của flavonoid chiết từ cây tiếp cốt thảo (Sambucus chinensis lindl)”. Tạp chí dược liệu, 3(4), 118-120.
4. Hộ, P. H. (2000). Cây cỏ Viêt Nam. Nxb Trẻ, tập 3, 223.
5. Hoàng, M. T., Nguyễn, Q. T., & Vũ, Q. S. (2006). Giáo trình sinh lý thực vật.
6. Lê Văn Hồng (2008). Cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Giáo trình.
7. Lương, Y. H., L, & H. V. V. (2001). Cây thuốc vị thuốc Đông y. Nxb Hà Nội.
8. Ngô, T. X., Nguyễn, T. D., Đặng, T. K. T., Nguyễn, T. H. T., Dương, Đ. H., Đỗ, Đ. G., & Trần, T. T. (2018). Xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trong mẫu lá xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill) và nghiên cứu sự phát sinh hình thái từ các nguồn mẫu khác nhau. Tạp chí khoa học Đại học Văn Lang 9: 30-39
9. Nguyễn Thị Mỹ Duyên, Trương Phi Yến, Nguyễn Vũ Phong (2020). Bước đầu tạo phơi vơ tính từ mơ sẹo lá cây xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum). Luận án Tiến sĩ, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học Tồn quốc 2020, 879-884.
10. Nguyễn, Đ. L. (2008). Công nghệ tế bào. NXB Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Moore, T. C. (2012). Biochemistry and physiology of plant hormones. Springer Science & Business Media.
11. Nguyễn, Đ. L. (2008). Công nghệ tế bào. NXB Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
12. Nguyễn, H. L. (2007). Giáo trình cơng nghệ tế bào. Nhà xuất bản đại học Huế.
13. Nguyễn, T. M. D., Trương, P. Y., & Nguyễn, V. P. (2020). Bước đầu tạo phơi vơ tính từ mơ sẹo lá cây xáo tam phân (Baramignya trimera (oliv.) guillaum)
14. Tiếp, Đ. Đ. (2020). Xác định thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính của một số hợp chất hóa học từ lồi cơm cháy (Sambucus javanica Reinew). Luận văn thạc sĩ hóa học, Đại học Thái Nguyên.
15. Tùng, T. T. (2019). Nghiên cứu hiện trạng tài nguyên một vài cây thuốc được người dân sử dụng tại xã Mường Lựm – huyện Yên Châu – tỉnh Sơn La. Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Lâm Nghiệp, Hà Nội.
16. Vũ Thị Hiền (2018). Nghiên cứu quá trình tái sinh và nhân giống in vitro cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et grushv.) bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào. Luận án Tiến sĩ Sinh học. Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tài liệu tham khảo nước ngoài
1. Acharya, J. and A. Mukherjee (2014). An account of Sambucus L. in the Himalayan regions of india. Indian Journal of Life Sciences, 4(1), 77-83.
2. Aryanto A. Tangkal Corona (2020). Eldeberry diyakini Tingkatkan
Imunitas. Published on the Internet.
https://www.wartaekonomi.co.id/read296929/tangkal-corona-eldeberry- diyakinitingkatkan-imunitas. Retrieved 7 August 2020. (In bahasa).
3. Avci, S., & Can, E. (2006). Efficient somatic embryogenesis from immature inflorescences of Dallisgrass (Paspalum dilatatum Poir). Propag. Ornam. Plants, 6: 134-139.
4. Bhaskaran S., & Smith R. H. (1990). Regeneration in cereal tissue cultures. Crop Sci., 30: 1328-1337.
5. Borkird, C., Choi, J. H., & Sung, Z. R. (1986). Effect of 2,4- dichlorophenoxyacetic acid on the expression of embryogenic program of carrot. Plant Physiol., 81: 1143-1145
6. Boroduske, A. (2020). Callus culture of black elder (Sambucus nigra): initiation and basic chemical characterization. In of the 78th scientific conference of the universityof Latvia (p. 59).
7. Byers, P. L., Tomas, A. L., Gold, M. A., Cernusca, M. M., & Godsey. L. D. (2014). Growing and Marketing Elderberries in Missouri.
Columbia, MO: University of Missouri.
8. Canhoto, J. M., Lopes, M. L. & Crus, G. S. (1999). Somatic embryogenesis and plant regeneration in myrtle (Myrtaceae). Plant Cell Tiss. Org. Cult., 57: 13-21
9. Cernusca, M., Gold, M., & Godsey. L. 2011. Elderberry Market
Research. Columbia, MO: University of Missouri.
10. Charlebois, D., & Brassard, N. (2013, June). Micropropagation of American elderberry: disinfection of explants. In I International Symposium on Elderberry 1061 (pp. 165-173).
11. Charlebois, D.,. Byers, P. L., Finn, C. E., & Tomas. A. L. (2010). “Elderberry: Botany, Horticulture, Potential.” Horticultural Reviews 37.
12. Cruz, G. S., Canhoto, J. M., & Abreu, M. A. (1990). Somatic embryogenesis and plant regeneration from zygotic embryos of Feijoa sellowiana Berg. Plant Sci., 66: 263-270
13. Darwis, W. (2012). Tanaman obat yang terdapat di kota bengkulu yang berpotensi sebagai obat penyakit dan gangguan pada sistem pencernaan manusia. Konservasi Hayati, 8(1), 1-15.
14. Dasopang, E. S. (2017). Skrining Fitokimia dan Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Sangitan (Sambucus javanica Reinw) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Eschericia coli dan Salmonella thypi. BIOLINK (Jurnal Biologi Lingkungan Industri Kesehatan), 4(1), 54-62.
15. Davies, P. J. (2012). Plant hormones and their role in plant growth and development. Springer Science & Business Media.
16. Davies, P. J. (2012). Plant hormones and their role in plant growth and development. Springer Science & Business Media.
17. Gill, R., & Saxena, P. K. (1992). Direct somatic embryogenesis and regeneration of plant from seedling explant of peanut (Arachis Hypogae L.). Can. J. Bot., 70: 1186-1192
18. Grebow, J. & Krawiec, S. (2020). Ingredients to Watch: Te List.
Nutritional Outlook 23:1.
19. Hesami, M., Daneshvar, M. H., & Yoosefzadeh-Najafabadi, M. (2018). Establishment of a protocol for in vitro seed germination and callus formation of Ficus religiosa L., an important medicinal plant. Jundishapur J Nat Pharm Prod, 13(4), e62682.
20. Kaoru, K., Hidehiko, B., Takaaki, K.,; Keisuke, F., & Tohru, M. (1993). Tissue culture of Aloe arborescens Miller var. natalensis Berger. doi:10.1002/ptr.2650070705
21. Kopper, E., Granilshchikova, M., Leichtfried, T., & Reisenzein, H. (2020). Micropropagation and pathogen elimination in elderberry (Sambucus nigra L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 142(3), 647-652.
22. Kumar, N., & Reddy, M. P. (2011). In vitro plant propagation: a review. Journal of forest and environmental science, 27(2), 61-72.
23. Maheshwaran, G., & Williams, E. G. (1986). Somatic embryogenesis factors influencing coordinate behavior of cells as an embryogenic group. Ann. Bot., 57: 442-462.
24. Malik, K. A., & Saxena, P. K. (1992). Regeneration in Phaseolus
vulgaris L.: High frequency induction of direct shoot formation in intact seedlings
by N6- benzylaminopurine and thidiazuron. Planta, 186: 384-389
25. Michler, C. H. (1995). Somatic embryogenesis in Populus spp. In: Somatic embryogenesis in Woody Plants,Jain S.M., Gupta P.K. and Newton R.J.
26. Moore, T. C. (2012). Biochemistry and physiology of plant hormones. Springer Science & Business Media.
27. Murashige, T. (1974). Plant propagation through tissue cultures. Annual review of plant physiology, 25(1), 135-166.
28. Murasnige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio agsays with tohaoco tissue cultures. Physiol. plant, 15(3), 473-497. 29. Phillips, G. C., & Garda, M. (2019). Plant tissue culture media and practices: an overview. In vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 55(3), 242-257.
30. Putra, W. E., & Rifa’i, M. (2020). Assessing the Immunomodulatory Activity of Ethanol Extract of Sambucus javanica Berries and Leaves in Chloramphenicol-Induced Aplastic Anemia Mouse Model. Tropical Life Sciences Research, 31(2), 175.
31. Putra, W. E., & Rifa'i, M. (2019). Hematopoiesis Activity of Sambucus javanica on chloramphenicol-induced aplastic anemia mouse model. Natural Product Sciences, 25(1), 59-63.
32. Putra, W. E., & Rifa'i, M. (2019). Immunomodulatory Activities of Sambucus javanica Extracts in DMBA-Exposed BALB/c Mouse. Advanced pharmaceutical bulletin, 9(4), 619.
33. Putra, W.E., et al. (2020). T cells regulation modulated by Sambucus javanica extracts in DMBA-exposed mice. Journal of Herbmed Pharmacology, 9(4), 408-411.
34. Rintani, D. M. (2020). Punya khasiat lebih dibanding jeruk, apa itu buah elderberry? Published on the Internet.
35. Silalahi, Marina and Wakhidah, Anisatu Z. (2021). Sambucus javanica Reinw. ex Blume Viburnaceae.
36. Song, X. L., Lin, Y., Zhao, H. X., Dong, R., & Gu, D. F. (2011). Tissue Culture Research of Sambucus canadensis L. cv. Aurea [J]. Hubei Agricultural Sciences, 2.
37. Summart, J., Panichajakul, S., Prathepha, P., & Thanonkeo, P. (2008). Callus induction and influence of culture condition and culture medium on growth of Thai Aromatic rice, Khao Dawk Mali 105, cell culture. World Applied Sciences Journal, 5(2), 246-251.
38. Tabaeezadeh, Z., & Khosh-Khui, M. (1981). Anther culture of Rosa. Scientia Horticulturae, 15(1), 61-66.
39. Thomas KA, Martin KP, Chandel KPS (1996). In vitro multiplication of Alpinla calcarata Rose. Phytomorphol 46: 133 - 138.
40. Thomas, K. A., Martin, K. P., & Chandel, K. P. S. (1996). In vitro multiplication of Alpinla calcarata Rose. Phytomorphol 46: 133 – 138
41. Umehara, M., & Kamada, H. (2005). Development of the embryo proper and the suspensor during plant embryogenesis. Plant Biotechnol., 22: 253- 260.
42. Wang, G., Zhang, T., & Sun, H. (2012). Tissue culture and mass propagation of Sambucus williamsii Hance. Journal of Shenyang Agricultural University, 43(3), 284-288.
43. Weng J.-R., Lin C.-S., Lai H.-C., Lin Y.-P., Wang C.-Y., Tsai Y.- C., et al. (2019). Antiviral Activity of Sambucus Formosana Nakai Ethanol Extract and Related Phenolic Acid Constituents against Human Coronavirus NL63. Virus.