Theo phương pháp ly trích plasmid DNA vi khuẩn của Bartie (2004)
Ly trích plasmid vi khuẩn
− Vi khuẩn Aeromonas hydrophila được nuôi trong môi trường NB trên máy lắc 180 r.p.m.
− Cho 1.5ml dung dịch vi khuẩn vào ống eppendofl đem li tâm trong 2 phút ở 14000 vòng, ở 4oC. Bỏ phần dịch nổi, thêm 1,5ml dung dịch vi khuẩn và đem ly
− Cho vào 1ml dung dịch STE lạnh. Vortex. Ly tâm 14000 vòng trong 2 phút. Thu lấy phần viên.
− Cho vào 250µl dung dịch 1 + 10µg/ml RNase A lạnh. Vortex để viên vi khuẩn tan
− Thêm vào 250µl dung dịch 2, lắc nhẹ.
− Thêm 300µl dung dịch 3 lạnh.
− Ủ hỗn hợp trên trong nước đá 5 phút.
− Ly tâm ở 14000 vòng trong 10 phút .
− Cho phần dịch nổi ở trên sang ống eppendofl mới .
− Cho isopropanol vào với thể tích bằng với thể tích dịch nổi thu được. Ly tâm ở 14000 vòng trong 10 phút. Thu lấy phần viên.
− Rửa phần viên với 500µl ethanol 70%. Phơi khô phần viên trong 10 phút.
− Hòa tan phần viên trong 20µl−50µl TE và trữ lạnh.
Chạy điện di
Chuẩn bị bản gel 0,8% trong dung dịch đệm 1X TAE: cho 0,8g agarose + 100ml 1X TAE vào chai 250ml đun nóng cho đến khi agarose tan hòan toàn. Khi nhiệt độ khoảng 550C cho vào gel 0,25µg/ml Ethidium bromide và cho gel vào khuôn. Load mẫu: Dùng pipette cho 15µl mẫu và 5µl glycerol cho vào mỗi giếng
Tiến hành diện di ở dòng điện 60V ở 40C, khi mẫu chạy được khoảng 1 giờ tiến hành chụp hình gel và khi chạy được 1,5 giờ thì chụp hình lần nữa.
Đọc kết quả
Sử dụng E.coli 39R861 (147kb), và E.coli V517 (54kb) làm thang plasmid chuẩn. Sự hiện diện vạch của trọng lượng phân tử plasmid, cho thấy phương pháp ly trích thành công. Nếu vạch trọng lượng phân tử plasmid hiện không rõ ràng thì thực hiện lại phương pháp ly trích plasmid. Nếu trọng lượng plasmid không hiện thì lặp lại phương pháp ly trích plasmid ít nhất hai lần để xác định mẫu không có plasmid.