2.6.1 Chuyển gen trực tiếp vào tế bào thực vật:
• Tế bào thực vật cú một đặc điểm là cú một lớp thành tế bào rất vững chắc nờn rất khú tỏc động trực tiếp, thường cỏc phương phỏp chuyển gen trực tiếp trờn (trừ phương phỏp sử dụng sỳng bắn gen) đều được ỏp dụng phổ biến với protoplats đõy là thuật ngữ để chỉ tế bào thực vật đó được tỏch bỏ lớp thành tế bào bờn ngoài chỉ cũn lại màng nguyờn sinh và phần trong của tế bào. Màng nguyờn sinh cho phộp protoplat cú thể hấp thu vào tế bào cỏc đại phõn tử theo cơ chế của amip, khi đứng cạnh nhau chỳng cú thể hũa làm một gọi là dung hợp. Lợi dụng đặc tớnh này của protoplast người ta tiến hành chuyển trực tiếp cỏc đoạn DNA vào để tạo ra cỏc cỏ thể mới (Nguyễn văn Uyển, 1996)[8].
• 2.6.2 Chuyển gen vào tế bào thực vật qua trung gian là vi khuẩn
Agrobacterium tumefacients.
• Trong khi cỏc phương phỏp chuyển gen trờn khỏ phức tạp, đũi hỏi cỏc thiết bị đắt tiền thỡ chuyển gen vào tế bào thực vật qua trung gian
Agrobacterium lại tỏ ra rất cú hiệu quả mà khụng cần tới cỏc thiết bị phức tạp (Nguyễn văn Uyển, 1996)[8].
Agrobacterium là một loại vi khuẩn cú dạng hỡnh que, gram õm và thuộc họ vi khuẩn Rhizobraeae. Chỳng được phõn loại theo đặc tớnh gõy bệnh thực vật như sau: A.tumefacients gõy bệnh sần cõy, A.rhizogenes gõy bệnh rễ lụng và
A.radiobacter khụng độc. Chỳng cú khả năng sõm nhập vào cõy qua vết thương và gắn một đoạn DNA của chỳng vào bộ gen của tế bào thực vật, đõy là những gen mó húa cho việc hỡnh thành khối u và tổng hợp ra những chất dinh dưỡng đặc biệt giỳp cho vi khuẩn phỏt triển. Người ta đó tỡm thấy những axit amin lạ
mà thực vật khụng cú khả năng tổng hợp như: octopine, nopaline, agropine và succinamopine trong khối u. (john Draper, 1992)[17]. Mặt khỏc khối u tăng trưởng khụng cần cú cỏc chất kớch thớch sinh trưởng thực vật, như vậy cho phộp kết luận đó cú một sự biến đổi nhất định trong bộ mỏy di truyền của tế bào thực vật tại đõy. Người ta đó phỏt hiện ra tớnh gõy bệnh của những vi khuẩn này phần lớn là do cỏc gen ở plasmid tiếp hợp 200-250 kb quy định, ở A.tumefacients gọi là Ti-plasmid, ở A.rhizogenes gọi là Ri-plasmid.
Ti-plasmid:
Ti-plasmid là DNA vũng kộp, trũn cú cấu trỳc được chia thành bốn vựng chớnh. Qua nhiều nghiờn cứu cho thấy cú hai vựng chớnh cú tỏc động trực tiếp đến sự hỡnh thành khối u là vựng T-DNA (Transferred DNA) và vựng vir (virulence) cũn hai vựng cũn lại thỡ phụ trỏch quỏ trỡnh tiếp hợp và tỏi bản Ti-plasmid trong vi khuẩn. Trong quỏ trỡnh hỡnh thành khối u đoạn T-DNA sẽ được chuyển vào tế bào thực vật và gắn vào bội gen nhõn của tế bào thực vật. Vựng T-DNA cú kớch thước khoảng 24 kb và được giới hạn bởi trỡnh tự lặp lại khoảng 25b.p gọi là vựng bờ trỏi và bờ phải Ti-plasmid được chia thanh hai loại chớnh Octopine và Nopaline Ti-plasmid. (john draper, 1992)[17]
Tiến trỡnh gắn vào của vi khuẩn và tiến trỡnh di chuyển DNA cú liờn quan đến hiện tượng tiếp hợp. Những tế bào cõy bị thương tiết ra những phõn tử cú tớnh chất tớn hiệu, làm cho gen ở vựng vir của Ti-plasmid trở lờn hoạt động. Những chất kớch thớch này là cỏc hợp chõt phenol của thực vật như:
acetosyringone (AS) và α-hydroaceto syringone (OH-AS). Vựng vir bao gồm cỏc gen virA, B, C, D, E và G. Protein virA cú phõn tử khối là 92000, với chuỗi mó kết thỳc là cỏc axit amin ưa nước cú nhiệm vụ di chuyển phõn tử tớn hiệu AS từ mụ bị thương vào tế bào của Agrobacterium. AS được xem như hoạt động cú tớnh hỗ trợ với protein virG để kớch thớch sự thể hiện cỏc gen virB, C, D, E để cắt T-DNA ra khỏi Ti-plasmid và đưa nú vào tế bào cõy. (viện lỳa ĐBSCL-Hội thảo và tập huấn)[5].
Lợi dụng tớnh chất này, người ta tiến hành thay thế đoạn T-DNA bằng một đoạn gen mới mà người ta muốn chuyển vào tế bào thực vật, chuyển nạp lại vào vi khuẩn, nuụi cấy chung mụ tế bào thực vật với vi khuẩn. Sau một thời gian nhất định ta tiến hành nuụi cấy tỏi sinh mụ thực vật trờn mụi trường cú chất chọn lọc để nhận biết cỏc cỏ thể đó được chuyển gen và chất khỏng sinh để tiờu diệt vi khuẩn.
Để thực hiện quỏ trỡnh chuyển gen phải cú được vector chuyển gen. Tuy nhiờn Ti-plasmid hội tụ đủ cỏc yờu cầu của một vector chuyển gen nhưng nú lại khụng được sử dụng trực tiếp do:
- Kớch cỡ lớn khú thao tỏc.
- Khụng cú những điểm cắt đặc hiệu.[5].
Chớnh vỡ vậy người ta phải tiến hành sửa chữa Ti-plasmid trước khi sử dụng. Hiện nay cú hai loại vector đang được sử dụng:
- Co-intergrate vetor (vector đồng tương tỏc):
Hệ thống này đầu tiờn cần cú 2 plasmid: một Plamid nhỏ cú khả năng tự nhõn lờn trong E.Coli gọi là vector trung gian, plasmid thứ hai là Ti-plasmid đó được loại bỏ đoạn T-DNA và thay vào đú là một đoạn DNA tương đồng với vector trung gian núi trờn. người ta bố trớ trờn vector trung gian cỏc gen chỉ thị, chọn lọc và một điểm Cloning để cú thể chốn cỏc DNA mong muốn vào đú. Vector trung gian được nhõn lờn trong E.Coli sau đú được chuyển trở lại vào tế bào A.tumefacients bằng tiếp hợp. Trong tế bào vi khuẩn
A.tumefacients sẽ xảy ra quỏ trỡnh tỏi tổ hợp giữa vector trung gian và Ti- plasmid tạo thành một Plasmid đồng nhất - đõy chớnh là vector đồng hợp nhất, hay Co-intergrate vetor. Do tần số được đưa trở lại Agrobacterium rất thấp (từ 105 - 107) nờn vector này ớt được sử dụng. (john daper, 1992)[17]. - Binary vector (vector kộp):
Trờn cơ sở vựng vir hat động theo mụ hỡnh trans. Do đú vựng này cú thể được bố trớ trờn một Plasmid khỏc. Plasmid này được gọi là “helper” Ti-plasmid. Ơ “helper” Ti-plasmid, toàn bộ vựng T-DNA đó bị cỏt bỏ. Như vậy bõy giờ người ta cú một Plasmid khụng cú đoạn T-DNA nhưng cú vựng vir (Helper). Plasmid khụng cú gen vir nhưng lại mang đầy đủ cỏc macker chọn lọc và trờn vựng T- DNA được thiết kế một điểm clone là vị trớ mà tại đú ta cú thể cài vào cỏc đoạn DNA mong muốn. Khỏc với co-intergrate vector, binary vector cần cú hệ thống hai Plasmid. Hệ thống này cho hiệu quả chuyển gen cao hơn nờn hiện nay được sử dụng phổ biến hơn.
Ưu điểm của phương phỏp này là: - Cú hiệu quả cao.
- Kết gắn vào genom của tế bào cõy ở những vị trớ ngẫu nhiờn, số bản sao kết gắn ớt hơn trường hợp chuyển gen trực tiếp.
Nhược điểm của phương phỏp này là:
- Hiệu quả của chuyển nạp tựy thuộc vào loại cõy trồng và khả năng tỏi sinh của tế bào chuyển nạp
- Hiệu quả của chuyển nạp cũn phụ thuộc vào tuổi cõy và giai đoạn sinh lý của tế bào.[5].
Đối với chuyển gen Bt ở nước ta hiện cũng sử dụng chủ yếu là phương phỏp này. Gen Bt là đoạn DNA mó húa cho sự tổng hợp cỏc protein độc tố trong tế bào vi khuẩn Bacillus thuringensis, được phỏt hiện và nghiờn cứu từ năm 1915 (Nguyễn văn Uyển, 1997)[10]. Vi khuẩn Bt được chia ra nhiều nũi (Serotype) cú tớnh độc rất chuyờn tớnh ở những nhúm sõu khỏc nhau.
Phần III
Nội dung và phơng pháp nghiên cứu
VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU A. ĐốI TƯợNG HOA LILY
Vật liệu:
- Oriental Sberia - hoa trắng
Phơng pháp nghiên cứu
Sử dụng phơng pháp nghiên cứu nuôi cấy mô hiện hành
Phơng pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phơng pháp nuôi cấy vi khuẩn
Nguồn vi khuẩn: Vi khuẩn đợc lu giữ trong tủ lạnh -200C ữ -800C
Môi trờng nuôi cấy khuẩn AB
Để pha 1 lít môi trờng AB cần hấp tiệt trùng 5 g glucose và 15 g bacto- agar trong 900ml nớc cất. Sau khi hấp xong cho vào dung dịch 50ml của 20x AB buffer và 20x AB salts đã đợc hấp tiệt trùng. Bổ sung kanamycin để có nồng độ 50mg/l. Kanamycin đợc bổ sung khi nhiệt độ môi trờng khoảng 500C. Môi trờng đổ vào đĩa petri, 25mg/đĩa.
20x AB buffer (cho 1 lít): 30 g K2HPO4 và 4 g NaH2PO4
20x AB Salts (cho 1 lít): 20 g NH4Cl, 6 g MgSO4.7H2O, 3g KCl, 3g CaCl2.2H2O và 50mg FeSO4.7H2O.
Thành phần môi trờng YEB Tripton (pepton) 10,0 g/lít NaCl 5,0 g/lít Cao nấm men 10,0 g/lít AS 20mg/lít Kanamycin 50mg/lít PH 7,0
Nuôi cấy ở 280C, 24 giờ, lắc 200 vòng/phút.
(a) Môi trờng nuôi cấy vi khuẩn: môi trờng YEB lỏng, 20mg/l AS + … kháng sinh chọn lọc, nuôi 24 giờ ở 280C, 200 vòng/phút.
(b) Dịch vi khuẩn đợc ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 20 phút ở điều kiện nhiệt độ phòng và đợc pha loãng trong môi trờng tới khi có OD600 =0,3.
(c) Môi trờng pha loãng vi khuẩn: MS (NH4NO3 –free), 20mg/l AS, 30g/l sucrose,
10g/l gluco,10mM MES/l, 1mg/l 2.4D, 0.2mg/l BA, 1g/l cassamino acid, 700mg/l L-asparagine monohydrat, 700mg/l L-glutamine, pH = 5,2.
Môi trờng nuôi cấy mẫu.
(a) Môi trờng tái sinh callus: MS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 3g/l phytagel, 1mg/l 2.4D, 0.2mg/l BA, pH = 5,3 - 5,5.
(b) Môi trờng đồng nuôi cấy cho hoa lily: MS (NH4NO3 –free), 20mg/l AS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 3g/l phytagel, 10mM MES/l, 1mg/l 2.4D, 0.2mg/l BA,
1g/l cassamino acid, 700mg/l L-asparagine monohydrat, 700mg/l L-glutamine, pH = 5,2.
(c) Môi trờng đồng nuôi cấy cho hoa đồng tiền: MS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, ,
10mM MES/l, 1mg/l 2.4D, 0.2mg/l BA, 1g/l cassamino acid, 700mg/l L- asparagine monohydrat, 700mg/l L-glutamine, pH = 5,2.
(d)
(e) Môi trờng diệt vi khuẩn: MS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 3g/l phytagel, 1mg/l 2.4D, 0.2mg/l BA, pH = 5,2 – 5,5, 300mg/l cefotaxim (có thể sử dụng tới 400mg/l). (f) Môi trờng chọn lọc: MS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 3g/l phytagel, 1mg/l 2.4D,
0.2mg/l BA, pH = 5,2 – 5,5, 300mg/l cefotaxim, 50mg/l kanamycin.
Phơng pháp nhiễm mẫu với vi khuẩn
• Cách 1. Mẫu cấy đợc nhúng vào dung dịch vi khuẩn trong thời gian từ 5 phút sau đó vớt ra, để khô trên giấy thấm vô trùng.
• Cách 2. Mẫu cấy đợc cấy trên môi trờng lây nhiễm sau đó dùng micropipet hút dịch vi khuẩn trên nhỏ vào mẫu, mỗi mẫu cấy chỉ nhỏ 10àl dung dịch vi khuẩn.
Phơng pháp rửa vi khuẩn
Vi khuẩn đợc rửa 2-3 lần bằng nớc cất vô trùng hoặc môi trờng MS vô trùng sau đó đợc tráng lại bằng dung dịch kháng sinh cefotaxime nồng độ 300ppm. Thao tác rửa cần nhanh (trong vòng 30 giây đến 1phút một lần rửa), chính sác, tránh nhiễm tạp.
QUY TRìNH CHUYểN GEN NHấ VI KHUẩN AGROBACTERIUM
VΜO CâY LILY
Bớc 1. Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị huyền phù vi khuẩn
- Nuôi vi khuẩn trên môi trờng AB (280C, 48 giờ)
- Nuôi vi khuẩn trên môi trờng YEB (280C, 48 giờ, 200 vòng/phút)
- Chuẩn bị môi trờng dùng để pha loãng vi khuẩn, bổ sung 20mg/l AS, đo OD600 lấy giá trị mẫu blank.
- Dịch vi khuẩn đợc ly tâm để lấy sinh khối tế bào vi khuẩn ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút ở điều kiện nhiệt độ phòng và đợc pha trong môi trờng pha loãng vi khuẩn tới khi có OD600 =0,3.
Bớc 2. Chuẩn bị mẫu cấy
- Callus: Cắt callus thành các lớp có kích thớc 5 x 5 x 2mm (dài, rộng, cao)
- Phần mô thân: cắt theo chiều ngang để đợc mẫu cấy có kích thớc 0,5mm.
- Phần vảy củ: cắt bỏ phần lá trên và cắt bỏ phần gốc sau đó mẫu đợc cắt thành các lớp mỏng có chiều dày 0.5-1mm hoặc khối mô có độ dày là 2 – 5mm.
- Mẫu cấy đợc đặt và cắt phía dới môi trờng lây nhiễm (mẫu ngập trong môi tr- ờng.
Bớc 3. Nhiễm mẫu với vi khuẩn.
- Cách 1. Mẫu cấy đợc nhúng vào dung dịch vi khuẩn trong thời gian từ 5 phút sau đó vớt ra, để khô trên giấy thấm vô trùng.
- Cách 2. Mẫu cấy đợc cấy trên môi trờng lây nhiễm sau đó dùng micropipet hút dịch vi khuẩn trên nhỏ vào mẫu, mỗi mẫu cấy chỉ nhỏ 10àl dung dịch vi khuẩn.
- Mẫu để ráo nớc trên giấy thấm vô trùng, sau đó đợc cấy vào môi trờng đồng nuôi cấy
Bớc 4. Nuôi cấy mẫu
- Mẫu đợc nuôi cấy trong tối, 22 ữ 240C trong 7 ngày.
Bớc 5. Xác định kết quả
- Mẫu cấy đợc rửa sạch vi khuẩn sau đó đợc bỏ vào các ống effendoff hoặc vào giếng ELISA. Chú ý có mẫu đối chứng âm.
- Bổ sung X-GLUC đến khi ngập mẫu
- ủ qua đêm ở nhiệt độ 370C, điều kiện tối
- Hút dịch nhuộm
- Bổ sung dung dịch phá cấu trúc chlorophyll, lắc nhẹ, ngâm khoảng 15-60 phút (có thể dài hơn). Thao tác này có thể tiến hành nhiều lần đến khi thấy mẫu có mầu trắng (hết chlorophyll).
- Soi mẫu dới kính lúp để quan sát sự nhuộm mầu GUS.
Nếu có sự chuyển gen và gen đó đợc biểu hiện thì tại vị trí mà tế bào đó đợc chuyển gen sẽ có mầu xanh chàm đặc trng. Mầu xanh chàm có dạng các điểm có kích thớc nhỏ.
Nếu không có gen đợc biểu hiện thì mẫu cấy sẽ không có mầu xanh chàm.
Bớc 6. Chuyển mẫu qua môi trờng diệt vi khuẩn(môi trờng phục hồi)
- Mẫu cấy đợc rửa sạch vi khuẩn, để ráo nớc trên giấy thấm vô trùng, sau đó đợc cấy vào môi trờng diệt vi khuẩn.
- Điều kiện nuôi cấy: 250C, trong bóng tối.
- Thời gian nuôi cấy phục hồi: 5-7 ngày.
Bớc 7. Chuyển mẫu qua môi trờng chọn lọc
- Mẫu đợc cấy chuyển định kỳ 2 hoặc 3 tuần/lần xang môi trờng chọn lọc mới. Lặp lại thao tác cấy chuyển trên môi trờng chọn lọc 3 - 4 lần.
- Điều kiện nuôi cấy: 250C, trong bóng tối.
Bớc 7. Cảm ứng tạo rễ cho các chồi tái sinh
- Mẫu đợc cấy chuyển xang môi trờng cảm ứng tạo rễ.
- Điều kiện nuôi cấy: 250C, chiếu sáng 16h.
Bớc 8. Chọn lọc cây chuyển gen bằng Histochemical staning, PCR và Southern blot
Nội Dung Thí Nghiệm
Thí nghiệm 1: ảnh hởng cả thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium.
Nghiệm thức Thời gian đồng nuôi cấy ( ngày) 1 Đối chứng (không lây nhiễm với vi khuẩn)
2 5
3 7
4 10
Thí nghiệm 2: ảnh hởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium.
Nghiệm thức Nguồn mẫu cấy
1 Đối chứng (không lây nhiễm vi khuẩn)
2 callus 3 mô lá 4 mô thân 5 lớp mỏng vảy củ 6 vảy củ 7 đỉnh sinh trởng
Thí nghiệm 3: ảnh hởng của phơng pháp cắt mẫu đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium.
Nghiệm thức Phơng pháp cấy mẫu
1 Đối chứng (không lây nhiễm với vi khuẩn)
2 Mẫu đợc cắt trên giấy thấm, (không nhúng trong môi trờng) 3 Mẫu cắt trong môi trờng đồng nuôi cấy
4 Mẫu cắt trong môi trờng đồng nuôi cấy đã pha loãng với vi khuẩn
Thí nghiệm 4: ảnh hởng của việc nuôi cấy kèm mẫu sau khi nhiễm với vi khuẩn với mô lá cấy thuốc lá đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn
Agrobacterium.
Một số nghiên cứu cho thấy : thuốc lá là cây có khả năng tái sinh tạo chồi, callus trên các môi trờng nuôi cấy mà không cần có những tác động nhiều về môi trờng cũng nh chất điều tiết sinh trởng hay chế độ nuôi cấy. việc nghiên cứu ảnh hởng của phơng pháp nuôi cấy kèm với mô lá cây thuốc lá nhằm nâng cao khả năng tái sinh của mẫu cấy đã đợc nghiên cứu và áp dụng và có kết quả rất khả quan trên một số đối tợng cây trồng khó tái sinh.
Chính vì vậy, mục tiêu của các thí nghiệm dới đây là tìm hiểu ảnh hởng của việc nuôi cấy kèm với mô lá cấy thuốc lá đến khả năng tái sinh của mẫu cấy lily sau khi đã đồng nuôi cấy với vi khuẩn.
Nghiệm thức Phơng pháp nuôi cấy mẫu
1 Đối chứng (không lây nhiễm với vi khuẩn)
2 Mẫu cấy
3 Mẫu cấy + mô lá thuốc lá
Thí nghiệm 5: ảnh hởng của tiền nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium.
Nghiệm Thức Thời gian tiền nuôi cấy (ngày)
1 2
2 3
3 5
Phần IV. Kế Hoạch Và Dự Kiến Kết Quả Đạt Đợc