Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá ruột ở gà, vịt nuôi tại 3 huyện thuộc tỉnh Thá
3.1.3. Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá ruột ở gà, vịt qua mổ khám
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá ruột ở gà, vịt nuôi tại một số huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá ruột theo tuổi gà
2.3.1.4. Nghiên cứu sự phát triển của trứng sán lá ruột gà và sự tồn tại của ấu trùng sán lá ruột gà trong môi trường nước
- Nghiên cứu thời gian phát triển của trứng sán lá ruột gà thành Miracidium trong môi trường nước.
2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý, lâm sàng của gà, vịt bị bệnh sán lá ruột
- Biểu hiện lâm sàng của gà mắc bệnh sán lá ruột tại địa phương - Bệnh tích đại thể ở đường tiêu hóa của gà, vịt bị bệnh sán sán lá ruột - Bệnh tích vi thể do sán lá ruột gây ra ở gà, vịt
2.3.3. Nghiên cứu biện pháp phòng trị sán lá ruột cho gà, vịt
- Thử nghiệm hiệu lực của một số loại thuốc tẩy sán lá ruột cho gà, vịt trên diện hẹp - Kết quả dùng thuốc tẩy sán lá ruột cho gà, vịt trên diện rộng.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Bố trí điều tra tình hình nhiễm sán lá ruột ở gà, vịt. Mẫu phân được lấy ngẫu nhiên trên đàn gà, vịt nuôi tại 3 huyện của tỉnh Thái Nguyên.
2.4.2. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu được thu thập tại các nông hộ chăn nuôi gà, vịt ở tại tại 3 huyện của tỉnh Thái Nguyên theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc (Nguyễn Như Thanh, 2001).
- Cách lấy mẫu phân: Thu thập mẫu phân mới thải của gà, vịt ở mọi lứa tuổi tại 3 huyện của tỉnh Thái Nguyên. Để riêng mỗi mẫu phân vào một túi nilon nhỏ, trên mỗi túi có ghi nhãn với các thơng tin: tên chủ hộ, thời gian, địa điểm lấy mẫu, giống gia cầm, tuổi gia cầm, trạng thái cơ thể và biểu hiện lâm sàng (nếu có). Mẫu được xét nghiệm ngay trong ngày hoặc xét nghiệm sau khi bảo quản theo quy trình bảo quản mẫu trong nghiên cứu ký sinh trùng.
Riêng đối với mẫu phân vịt, tiến hành rải nilon trên nền chuồng, khi vịt thải phân trên túi nilon thì tiến hành thu thập những mẫu phân này.
2.4.3. Phương pháp xét nghiệm mẫu
- Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm sán lá ruột qua xét nghiệm phân:
Tất cả mẫu phân được xét nghiệm bằng phương pháp gạn rửa sa lắng (Benedek). Nguyên lý cơ bản của phương pháp này là sử dụng nước để phân lập trứng sán lá, do tỷ trọng của trứng sán lá lớn hơn tỷ trọng của nước lã nên trứng sẽ lắng xuống dưới (Phạm Văn Khuê và Phan Lục, Nguyễn Thị Kim Lan, 2012).
Phương pháp gạn rửa sa lắng tiến hành như sau: Lấy mẫu phân cho vào cốc thuỷ tinh có nước lã, khuấy mạnh cho tan phân, lọc qua lưới lọc vào một cốc thuỷ tinh, để yên cho lắng cặn xuống, gạn nước ở trên đi; lại cho nước vào, để yên 15 phút cho lắng xuống và gạn nước ở trên đi... Làm liên tục nhiều lần cho đến khi nước trong suốt, gạn nước đi và cho cặn vào hộp lồng soi kính hiển vi tìm trứng sán lá ruột, soi kính hiển vi có độ phóng đại 100 lần, đếm số trứng sán lá ruột/ vi trường. Những mẫu xét nghiệm thấy có trứng sán lá ruột được đánh giá là có nhiễm và ngược lại là không nhiễm.
Cường độ nhiễm sán lá ruột ở gà, vịt sẽ căn cứ vào toàn bộ số lượng trứng sán lá đếm được trên 1 vi trường kính hiển vi, được đánh giá ở 4 mức:
+ Nhiễm nhẹ: 1 - 5 trứng/ vi trường (ký hiệu +)
+ Nhiễm trung bình: 6 - 10 trứng/ vi trường (ký hiệu ++)
+ Nhiễm nặng: 11 - 15 trứng/ vi trường (ký hiệu +++)
+ Nhiễm rất nặng: > 15 trứng/ vi trường (ký hiệu ++++)
Ghi chú: Việc xác định cường độ nhiễm sán lá ruột ở vịt và gà tại các địa phương được căn cứ vào số lượng trứng sán/ vi trường kết hợp với các triệu chứng lâm sàng thể hiện. Mức quy định cường độ nhiễm sán lá ruột ở gà, vịt này chỉ áp dụng trong xét nghiệm những mẫu phân gà, vịt trên địa bàn 3 huyện Phú Lương, Phú Bình, Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên.
2.4.4. Phương pháp theo dõi sự phát triển của trứng sán lá ruột trong mơi trường nước
- Cách bố trí thí nghiệm: Thu thập trứng của gà, vịt bị bệnh sán lá ruột từ nặng đến rất nặng, sau đó để vào các cốc thủy tinh có chứa nước lã.
Phương pháp kiểm tra và đánh giá sự phát triển của trứng sán lá ruột: Hằng ngày, vào một khoảng thời gian nhất định, lấy khoảng 3 - 5 giọt nước từ các mẫu để kiểm tra hình thái, màu sắc, sự biến đổi của tế bào phôi bên trong trứng. Từ đó, xác định được thời gian phát triển của trứng trong môi trường nước.
Đếm tổng số trứng/ vi trường kính hiển vi, đếm số trứng phát triển, từ đó tính tỷ
lệ trứng có ấu trùng/ tổng số trứng có trên vi trường kính hiển vi.
Thí nghiệm được thực hiện trong 2 mùa vụ:Xuân-Hè và Thu-Đông
Đánh giá sự phát triển của trứng sán lá ruột thông qua phương pháp quan sát trực tiếp sự phát triển của phơi trứng dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần (10x10).
2.4.5. Phương pháp mổ khám và thu thập mẫu
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp mổ khám khơng tồn diện của Skrjabin K.I. (1963), với mục đích xác định tỷ lệ, cường độ nhiễm sán lá ruột và quan sát những biến đổi đại thể của cơ quan tiêu hoá do sán lá ruột gây ra. Căn cứ vào nội dung nghiên cứu, sau khi điều tra thu thập thông tin về nguồn gốc, lứa tuổi của gà và vịt tại các địa điểm điều tra, gà và vịt được chọn ngẫu nhiên để tiến hành mổ khám.
Trước khi mổ khám: làm chết gà, vịt sau đó mổ từ hậu môn đến xương ức để bộc lộ các nội quan, tách riêng từng bộ phận, lấy cơ quan tiêu hoá để kiểm tra (Lấy từ ruột non đến hậu môn).
Ruột non, ruột già, manh tràng được tách riêng và kiểm tra từng phần. Dùng kéo mũi nhọn cắt dọc theo thành ruột, quan sát bằng mắt thường và kính lúp để phát hiện sán lá ruột và thu mẫu sán trong chất chứa (sau khi gạn rửa sa lắng chất chứa) và những sán còn bám trên niêm mạc cho vào đĩa petri. Sau khi định loại sơ bộ, mỗi loài sán lá ruột được bảo quản ở lọ riêng (sơ bộ định danh). Mẫu vật sán của mỗi gà và vịt cũng được để riêng.
Mẫu sán lá ruột thu thập đều được bảo quản trong cồn 70o. Cách làm như sau:
để sán chết tự nhiên trong nước, sau khi rửa sạch, ép mỏng giữa 2 phiến kính rồi đặt
vào bình thuỷ tinh có chứa cồn 70o.
Sau thời gian ép mẫu, chuyển sang các lọ chứa cồn 70o và ghi nhãn với
các thơng tin: vị trí ký sinh, lớp, số lượng sán, số lượng gà mổ khám, tuổi gà, vịt địa điểm và thời gian mổ khám... Những thông tin ghi trên nhãn cũng được ghi đầy đủ vào sổ mổ khám.
2.4.6. Phương pháp làm tiêu bản để xác định tên loài sán
Để xác định lồi sán lá ruột chúng tơi sử dụng phương pháp làm tiêu bản sán lá theo phương pháp nhuộm Carmin (Nguyễn Thị Lê và cs., 1996). Cụ thể như sau:
- Phương pháp làm tiêu bản tạm thời:
Đặt mẫu sán lên lam kính, nhỏ một giọt dung dịch hỗn hợp gồm glyxerin + axít lactic + nước cất theo tỷ lệ 1:1:1 hoặc có thể làm trong mẫu bằng glyxerin mà khơng cần axít lactic. Thời gian làm trong mẫu tuỳ thuộc vào kích thước và độ dày mỏng của mẫu.
- Làm tiêu bản sán lá theo phương pháp nhuộm Carmin và gắn Baume cannada: Pha dung dịch nhuộm Carmin: Lấy 5g Carmin nghiền nhỏ cho vào bình tam
giác chứa 5ml HCl và 5ml nước cất, để yên sau 1 giờ, sau đó cho thêm 200ml cồn 90o,
lắc đều, đậy nút bông, đun cách thuỷ cho đến khi Carmin tan hết, để 1 ngày rồi lọc. Dung dịch để sau 1 tuần đến 10 ngày mới dùng.
- Nhuộm: Cho mẫu vào dung dịch nhuộm từ 5 phút đến 1 giờ tuỳ độ lớn của mẫu, đến khi mẫu bắt màu đẹp là được. Trường hợp bắt màu quá đậm, có thể làm nhạt
màu bằng cách cho mẫu sán vào dung dịch cồn - axít HCl 1% (100ml cồn 70o pha với
1ml HCl).
- Rút nước: Vớt mẫu sán ra, cho lần lượt vào dung dịch cồn ở các nồng độ: 70o,
90o, 95o để rút nước, mỗi nồng độ ngâm trong 5 đến 7 phút.
- Làm trong mẫu bằng dung dịch xylen + cồn 96o theo tỷ lệ 1:1 trong thời
gian 1 - 2 phút.
- Cố định tiêu bản: Nhỏ lên lam kính 1 - 2 giọt baume canada, đặt mẫu vào, nhỏ tiếp 1 giọt baume canada lên trên rồi đậy lamen lại. Để khô tiêu bản.
2.4.7. Phương pháp định danh các loài sán lá ruột
Việc định danh phân loại các loài sán lá ruột ký sinh ở gà, vịt dựa vào những đặc điểm hình thái, kích thước, cấu tạo theo hệ thống định loại sán lá (Nguyễn Thị Lê và cs., 1996).
Sau khi phân loại xong, thay nhãn cho các lọ mẫu. Nhãn ghi rõ số gà và vịt mổ khám, vị trí ký sinh, tên lồi sán lá ruột, số lượng, địa điểm, ngày tháng mổ khám, người mổ khám.
Kết quả định danh được ghi vào sổ mổ khám.
2.4.8. Phương pháp xác định bệnh lý lâm sàng và bệnh tích đại thể, những biến đổi vi thể ở cơ quan tiêu hoá (ruột non, manh tràng và ruột già) do sán lá ruột gây ra
- Bệnh lý lâm sàng được xác định bằng cách theo dõi tất cả những gà, vịt có kết quả kiểm xét nghiệm phân dương tính với sán lá ruột.
Xác định những biến đổi lâm sàng của gà, vịt bệnh bằng cách trực tiếp quan sát: mào, tích, thể trạng, phân, ăn uống, vận động... kết hợp với hỏi chủ hộ nuôi gà, vịt.
- Bệnh tích đại thể được xác định bằng cách quan sát kỹ những tổn thương ở niêm mạc ruột non, manh tràng và ruột già của những gà, vịt bị nhiễm sán lá ruột. Quan sát bằng mắt thường qua kính lúp các phần ruột gà và vịt để tìm bệnh tích của bệnh.
- Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể bằng phương pháp làm tiêu bản tổ chức học theo quy trình tẩm đúc Parafin, nhuộm Hematoxilin - Eosin, đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học Labophot - 2 và chụp ảnh bằng máy ảnh gắn trên kính hiển vi.
Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo thứ tự các bước sau:
+ Lấy bệnh phẩm: Cắt phần bệnh phẩm có nhiều sán lá ruột ký sinh (ruột non, ruột già và manh tràng).
+ Cố định bằng dung dịch formol 10% với tỷ lệ 1 phần bệnh phẩm với 9 phần formol 10%. Ruột gà cắt ngắn 3 - 5 cm và cố định trong 36 giờ.
+ Sau khi cố định, rửa tổ chức dưới vòi nước chảy nhẹ từ 12 - 24 giờ để loại bỏ Formol có trong tổ chức.
+ Khử nước: Dùng cồn nồng độ từ thấp đến cao dần để khử nước, cuối cùng dùng cồn tuyệt đối để rút hết nước trong bệnh phẩm ra.
+ Làm trong tiêu bản: Ngâm bệnh phẩm qua hệ thống xylen để làm trong bệnh phẩm.
+ Tẩm parafin: Ngâm bệnh phẩm đã làm trong vào các cốc đã đựng Parafin
nóng chảy, để ở tủ ấm nhiệt độ 56oC.
+ Đổ Block: Rót Parafin nóng chảy vào khuôn giấy rồi đặt miếng tổ chức (bệnh phẩm) đã tẩm Parafin vào, khi Parafin đơng đặc hồn tồn thì bóc khn. Sửa lại Block cho vuông vắn.
+ Cắt và dán mảnh: Cắt bệnh phẩm trên máy cắt microtom, độ dày mảnh cắt 3 - 4 µm. Dán mảnh cắt lên phiến kính bằng dung dịch Mayer (lòng trắng trứng gà 1 phần, glyxerin 1 phần; 1 ml hỗn hợp trên pha trong 19 ml nước cất).
+ Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxilin - Eosin. Phương pháp tiến hành như sau:
Trước tiên tẩy nến bằng Xylen, sau đó ngâm tiêu bản tổ chức vào cồn Ethanol 96% trong 5 phút. Tiêu bản tổ chức được rửa dưới dòng nước chảy nhẹ trong 5 phút và nhuộm Hematoxilin trong 5 phút, sau đó lại rửa nước trong 15 phút và nhuộm Eosin trong 1- 2 phút. Rửa nước (dưới dòng nước chảy nhẹ) và làm khô tiêu bản trong dung dịch cồn có nồng độ tăng dần 96% đến 100% với thời gian giảm dần từ 5 phút đến 2 phút.
2.4.9. Phương pháp theo dõi hiệu lực của thuốc tẩy sán lá ruột ở gà, vịt
2.4.9.1 Phương pháp bố trí và theo dõi thí nghiệm thử nghiệm thuốc tẩy sán lá ruột cho gà, vịt trên diện hẹp
Chúng tôi sử dụng 3 loại thuốc sau gồm: bio-fenbendazol, arecolin, piperazine để tẩy sán dây cho gà. Thành phần của mỗi loại thuốc như sau:
- Thuốc bio-fenbendazol gồm: fenbendazole, CaCO3, rice Hulls vừa đủ Liều dùng: 8mg/ kg TT
- Thuốc arecolin gồm: arecolin và tá dược Liều dùng: 2mg/ kg TT
- Thuốc piperazine gồm: piperazine và tá dược vừa đủ Liều dùng: 2mg/ kg TT
- Sử dụng thuốc 3 loại thuốc trên tẩy cho số lượng nhỏ gà, vịt mắc bệnh sán lá ruột (mỗi loại thuốc dùng cho 10 gà, 10 vịt); sau khi sử dụng thuốc 10 - 15 ngày, xét nghiệm lại phân gà bằng phương gạn rửa sa lắng. Nếu khơng tìm thấy trứng sán lá ruột trong phân thì xác định thuốc có hiệu lực triệt để đối với sán lá ruột; nếu vẫn thấy trứng sán lá ruột trong phân nhưng số lượng giảm rõ rệt thì xác định thuốc có hiệu lực với sán lá ruột nhưng không triệt để; nếu số lượng trứng vẫn không giảm hoặc giảm không đáng kể so với trước khi dùng thuốc thì xác định thuốc khơng có hiệu lực với sán lá ruột gà, vịt.
- Mổ khám những gà, vịt dùng thuốc tẩy sán lá ruột để tìm sán lá ruột. Nếu khơng tìm thấy sán lá ruột nào thì xác định thuốc có hiệu lực triệt để đối với sán lá ruột; nếu vẫn tìm thấy sán lá ruột nhưng số lượng ít thì xác định thuốc có hiệu lực với sán lá ruột nhưng không triệt để; nếu gà, vịt vẫn nhiễm nhiều sán lá ruột thì xác định thuốc khơng có hiệu lực với sán lá ruột gà, vịt.
2.4.9.2. Phương pháp đánh giá hiệu lực của thuốc tẩy sán lá ruột cho gà, vịt trên diện rộng
- Sau khi xác định được thuốc có hiệu lực tốt với sán lá ruột trên số lượng ít gà, vịt, tiếp tục dùng thuốc đó cho số lượng lớn gà, vịt ngoài thực địa. Kiểm tra lại phân sau 15 ngày dùng thuốc để xác định hiệu lực của thuốc.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê sinh vật học của Nguyễn Văn Thiện và cs, 2002, trên phần mềm Excel 2010.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ BỆNH SÁN LÁ RUỘT Ở GÀ, VỊT NUÔI TẠI 3 HUYỆN THUỘC TỈNH THÁI NGUYÊN THUỘC TỈNH THÁI NGUYÊN
3.1.1. Thành phần loài sán lá ruột ký sinh ở gà, vịt nuôi tại 3 huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên Thái Nguyên
Bảng 3.1. Những loài sán lá ký sinh ở ruột gà, vịt và tần suất xuất hiện của chúng tại 3 huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên
Thành phần lồi sán lá ruột ở gà
Vị trí ký sinh
Phân bố tại các địa phương
(huyện) Tần suất xuất hiện (%) Đồng Hỷ Phú Lương Phú Bình Hypoderaeum conoideum Bloch, 1782 Ruột non, manh tràng x x x 100 Echinostoma revolutum Frohlich, 1802 Ruột non, manh tràng x x - 67,70 Notocotylus intestinalis Tubangui, 1932 Ruột non, manh tràng x x x 100 Tổng loài phát hiện 3/3 3/3 2/3
Qua bảng 3.1 cho thấy, qua mổ khám và định loại sán đã phát hiện được 3 loài sán lá ký sinh ở ruột gà, vịt tại các địa điểm nghiên cứu trên. Sán lá ruột
Hypoderaeum conoideum và Notocotylus intestinalis xuất hiện ở tất cả các địa điểm
nghiên cứu với tần xuất 100%, loài Echinostoma revolutum chỉ thấy xuất hiện ở 2 huyện Đồng Hỷ và Phú Lương với tần suất xuất hiện 67,70%. Như vậy, gà và vịt
nuôi ở 3 huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên nhiễm 3 lồi sán lá ruột, đó là: Hypoderaeum