CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.3. Kết quả mang và giải phóngthuốc
3.3.4.4. Kết quả giải phóng DOX của PNS-APTES
Chất mang PNS-APTES được khảo sát giải phóng thuốc trong 96 giờ tại môi trường pH 7,4 và 4,5 (bảng 3.15 và hình 3.37).
Bảng 3.15. Số liệu giải phóng DOX của PNS-APTES tại pH 7,4 và 4,5
Thời gian giải phóng (giờ) Tỷ lệ giải phóng (%)
pH = 7,4 pH = 4,5 0 0 0 1 7,69 32,79 2 13,06 43,11 3 18,03 53,80 6 26,95 61,37 12 31,31 71,20 24 37,43 77,08 48 48,69 79,20 72 54,15 80,09 84 54,85 80,28 96 54,86 80,32
Hình 3.34. Đồ thị mơ tả khả năng giải phóng của PNS- APTES Đối với mơi trường pH 7,4:
Khảo sát thời gian 6 giờ đầu, hệ giải phóng thuốc với tốc độ chậm, lượng thuốc được hệ giải phóng khơng nhiều.
-Trong một giờ đầu tiên nghiên cứu tiến hành lấy mẫu 3 lần lượng thuốc trung bình giải phóng ra là 7,69 %.
-Tại thời điểm 6 giờ đến 12 giờ, nghiên cứu cũng tiến hành lấy mẫu 3 lần đo được lượng thuốc giải phóng là 31,31% thuốc được mang.
-Tại thời điểm 72 giờ, thì tổng lượng thuốc giải phóng là 54,15% lượng thuốc được mang. Nhận thấy rất rõ, so với các thời điểm trước thì q trình giải phóng thuốc bắt đầu yếu dần đi, thỏa mãn điều kiện mong muốn là giải phóng chậm.
Đối với mơi trường pH 4,5:
Khảo sát thời gian 6 giờ đầu, hệ giải giải phóng với tốc độ chậm, lượng thuốc được hệ giải phóng khá nhiều so với hệ 7,4.
-Trong một giờ đầu tiên nghiên cứu tiến hành lấy mẫu 3 lần lượng thuốc trung bình giải phóng là 32,79 %.
-Tại thời điểm từ 6 giờ đến 12 giờ, nghiên cứu cũng tiến hành lấy mẫu 3 lần với lượng thuốc được hệ giải phóng là 71,20% lượng thuốc được mang. Tại thời điểm này lượng thuốc được hệ giải phóng ra khá tốt
-Tại thời điểm 72 giờ, thì tổng lượng thuốc giải phóng là 80,10% lượng thuốc được mang. Nhận thấy rất rõ, so với các thời điểm trước thì q trình giải phóng bắt đầu tăng chậm và cao nhất ở 96 giờ là 80,32.
Sau khi khảo sát giải phóng DOX của hệ PNS-APTES, từ số liệu cho thấy, ở mơi trường pH 7,4 hệ silica được biến tính APTES giải phóng thuốc rất yếu, chỉ có 54,85% sau 96 giờ, ít hơn lượng thuốc mà hệ giải phóng ở môi trường pH 4,5 là 80,32% tại thời điểm 96 giờ. Vậy thỏa điều kiện là giải phóng tốt trong điều kiện pH kém pH 4,5 (gần giống pH của tế bào ung thư) và giải phóng ít trong mơi trường pH 7,4 (gần giống pH của tế bào lành). 3.3.5. Kết quả mang và giải phóng PNS-APTES-Anhydrid Succinic-Gelatin (PNS- APTES-COOH-GE là chất mang thuốc 4)
3.3.5.1. Kết quả mang 5-FU của PNS-APTES-COOH-GE
Để xác định khối lượng thuốc trong mẫu cần dùng phương pháp đo HPLC và đường chuẩn đã lập để xác định hàm lượng thuốc trong hai dung dịch A (dung dịch trước mang thuốc) và dung dịch B (dung dịch sau mang thuốc). Sau khi có được nồng độ thuốc 5-FU trong hai dung dịch ta có thể tính được khối lượng thuốc, gọi là mA và mB. Qua đó, khối lượng thuốc chứa trong hạt được tính như sau mA - mB. Khối lượng thuốc ban đầu là mA và
tổng khối lượng mẫu và thuốc trong mẫu sẽ bao gồm khối lượng thuốc trong mẫu và 50mg mẫu ban đầu. Kết quả đo như sau:
Bảng 3.16. Kết quả đo dung dịch A và B (trước và sau mang thuốc 5-FU của hệ PNS- APTES-Anhydrid Succinic-GE)
Dung dịch Diện tích peak
(mAU*s) Nồng độ (ppm) Khối lượng (mg) A 40256,2 1256,443 13,8209 B 35232,3 1099,598 10,9960
Từ kết quả trên ta sẽ xác định được hai giá trị DLE và DLC bằng công thức ở mục 3.3.1.4
DLE (%) = 20,44 (%) và DLC (%) = 5,35 (%).
Sau những khoảng thời gian tiến hành thí nghiệm giải phóng trong hai mơi trường khác nhau và tiến hành đo HPLC nhận thấy lượng 5-FU đã bị dính chặt trong chất mang khơng thể giải phóng trong cả 2 mơi trường là pH 7,4 và pH 4,5.
Nhận xét
Mặc dù hệ biến tính PNS- APTES-COOH-GE có hiệu suất mang thuốc 5-FU cao hơn so với so với hệ PNS chứa biến tính nhưng vẫn thấp hơn hiệu suất mang thuốc 5-FU của hệ PNS-GPTMS-Hydrazine và PNS-GPTMS-CS-mPEG đó là do hệ biến tính Gelatin có cấu trúc lớn có thể làm cản trở tương tác tĩnh điện của thuốc 5-FU và chất mang.
3.3.5.2. Kết quả giải phóng 5-FU của PNS-APTES-COOH-GE
Tương tự các hệ biến tính trước mang 5-FU, hệ PNS-APTES-COOH-GE cũng mang 5- FU bằng cách cho 60 mg chất mang vào ống nhỏ giọt, sau đó đổ dung dịch có chứa 15 mg thuốc 5-FU cho chảy qua, bên dưới hứng và cho chảy qua ống nhiều lần. Tiếp theo thẩm tách đo thuốc được mang và giải phóng trong thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ với 2 môi trường dung dịch đệm phosphat (PBS)(pH 7,4) và đệm acetat (pH 4,5). Kết quả HPLC cho thấy lượng thuốc giải phóng ra bằng 0 (mg). Vậy 5-FU đã bị giữ chặt trong PNS-APTES-COOH- GE khơng thể giải phóng ra trong 2 mơi trường đệm.
Hình 3.35. Phổ HPLC của 5-FU (a) và HPLC của hệ PNS-APTES-COOH-GE
mang 5-FU giải phóng (b) 3.3.5.3. Kết quả mang DOX của PNS-APTES-COOH-GE
Tương tự các thí nghiệm khảo sát mang thuốc DOX trên PNS đã biến tínhvà dựa vào phương pháp so màu bằng UV-Vis cùng với đường chuẩn của thuốc DOX đã xây dựng ở phần trên ta sẽ xác định được hai giá trị DLE và DLC lần lượt là 55,90 ± 1,72%và 10,06 ±
0,32 %.
3.3.5.4. Kết quả giải phóng DOX của PNS-APTES-COOH-GE
Sau những khoảng thời gian tiến hành thí nghiệm giải phóng trong hai mơi trường khác nhau và tiến hành đo UV-VIS, quy đổi thành nồng độ ta thu được số liệu được biểu diễn trong đồ thị sau
Bảng 3.17. Số liệu giải phóng DOX của PNS-APTES-COOH-GE tại pH 7,4 và 4,5
Thời gian giải phóng (giờ) Tỷ lệ giải phóng (%)
pH = 7,4 pH = 4,5
0 0,00 0,00
1 6,29 18,71
3 13,37 41,34 6 15,33 44,46 12 16,71 59,65 24 20,55 60,35 48 22,17 63,15 72 25,59 66,27 84 26,15 66,35 96 26,57 67,51
Hình 3.36. Đồ thị biểu diễn khả năng giải phóng DOX của PNS-APTES-COOH-GE
Qua kết quả có thể thấy được thuốc DOX có thể giải phóng trong cả hai môi trường (pH=4,5 và pH=7,4). Tuy nhiên theo đồ thị có thể thấy trong mơi trường đệm pH = 4,5 hiệu suất thuốc có thể giải phóng cao hơn nhiều so với môi trường pH = 7,4 ở những khoảng thời gian tương đương nhau. Ngồi ra theo đồ thị có ta có thể thấy ở cả hai mơi trường lượng thuốc giải phóng được có sự tăng nhanh và mạnh trong khoảng 20 giờ đầu, sau đó lượng thuốc có thể giải phóng khơng cịn nhiều nữa nên sau 20 giờ đầu đồ thị có xu hướng gần như là một đường thẳng (đặc biệt là trong khoảng 72-96 giờ). Trong môi trường pH 7,4 hiệu suất giải phóng thuốc tối đa có thể đạt khoảng 20% trong khi đó ở cùng một khoảng thời gian tương tự hiệu suất tối đa có thể giải phóng trong môi trường pH 4,5 là 60-65%, đây là một kết quả rất cao và khả quan. Điều này cũng là một trong những tiêu chí mong muốn của thí nghiệm .
3.3.6. Kết quả mang và giải phóng PNS-APTES-Anhydrid Succinic- Gelatin-mPEG(gọi tắt là PNS-GEL-mPEG là chất mang thuốc 5) (gọi tắt là PNS-GEL-mPEG là chất mang thuốc 5)
3.3.6.1. Khảo sát khả năng mang 5-FU của hệ PNS-GEL-mPEG
Dùng phương pháp đo HPLC lượng thuốc tự do được sau 1 giờ, 3 giờ và 6 giờ, ta có kết quả như sau:
Bảng 3.18. Số liệu biểu thị khối lượng thuốc 5-FU được mang trong 60 mg PNS-GEL- mPEG
Mẫu Lượng thuốc tự do
(mg)
Lượng thuốc được mang (mg)
PNS-GEL-mPEG 5,95 9,05
Từ dữ liệu HPLC ta tính được hiệu suất tải thuốc và khả năng mang thuốc 5-FU của chất mang PNS-GEL-mPEGlà DLE = 63,33 ± 1,12% và DLC = 13,10± 0,32%.
3.3.6.2. Khảo sát khả năng giải phóng 5-FU của hệ PNS-GEL-mPEG
Sau khi hệ PNS-APTES-Ge-mPEG mang 5-FU, ta tiến hành giải phóng trong thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 24 giờ và 48 giờ với 2 môi trường dung dịch đệm phosphat (PBS)(pH 7,4) và đệm acetat (pH 4,5). Kết quả HPLC cho thấy lượng thuốc giải phóng ra bằng 0 (mg). Vậy 5-FU đã bị giữ chặt trong PNS-APTES-Anhydrid Succinic-Ge-mPEG, không thể giải phóng ra trong 2 mơi trường đệm.
Hình 3.37. Phổ HPLC của 5-FU (a) và HPLC của hệ PNS-GEL-mPEG mang 5-FU giải phóng (b)
Nhận xét
So với hệ PNS-GPTMS-CS-mPEG thì hệ PNS-GEL-mPEG mang thuốc 5-FU có hiệu quả mang cũng khá tốt nhờ tương tác tĩnh điện giữa thuốc và chất mang đã biến tính tuy nhiên khi giải phóng 5-FU thì thuốc cũng bị giữ chặt trong chất mang PNS-GEL-mPEG, khơng thể giải phóng thuốc 5-FU trong 2 mơi trường trung tính và acid.
3.3.6.3. Kết quả mang thuốc DOX của PNS-GEL-mPEG
Xác định lượng thuốc chưa mang được, ta có thể dễ dàng phân tích được hiệu suất mang thuốc và khả năng mang thuốc DOX của hệ PNS-APTES- GEL-mPEG bằng cách đo UV vis lượng thuốc thừa chưa mang được, ta có kết quả như sau:
Hiệu suất mang thuốc DLE = 85,88 ± 1,15%
Khả năng chứa thuốc của chất mang DLC = 17,64 ± 0,02%
Nhận xét
So với hệ PNS chưa biến tính và các hệ PNS biến tính trước đó thì đây là hệ có hiệu suất mang thuốc (DLE = 85,88 ± 1,15 %) và khả năng chứa thuốc của chất mang (DLC = 17,64 ± 0,02%) cao nhất. Với hiệu suất cao là nhờ sự hình thành liên kết imine giữa nhóm amino của thuốc DOX và chất mang PNS đã biến tính [91, 92]. Chẳng những nhờ liên kết imine cho hiệu quả mang thuốc DOX khá cao mà còn hứa hẹn khả năng chọn lọc giải phóng DOX tuyệt vời [91].
3.3.6.4. Khảo sát khả năng giải phóng DOX của hệ PNS-GEL-mPEG
Chất mang PNS-APTES-Anhydrid Succinic-GEL-mPEG được khảo sát giải phóng DOX trong 96 giờ và trong môi trường pH 7,4 . Nghiên cứu cũng tiến hành khảo sát tương tự như thí nghiệm ở pH 4,5.
Bảng 3.19. Khả năng giải phóng DOX của hệ PNS- GEL-mPEG ở pH 7,4 và 4,5
Thời gian giải phóng (giờ) Tỷ lệ giải phóng (%)
pH = 7,4 pH = 4,5 0 0 0 1 7,30 22,77 2 12,40 35,29 3 17,00 47,70 6 22,40 53,50
12 27,90 65,80 24 30,06 70,06 36 32,30 74,30 48 33,20 75,03 72 33,30 75,07 84 33,30 75,09 96 33,30 75,09
Hình 3.38. So sánh giải phóng DOX của PNS và PNS-GEL-mPEG tại pH 7,4 và4,5 Đối với môi trường pH 7,4: 4,5 Đối với môi trường pH 7,4:
- Trong 6 giờ đầu, hệ giải phóng thuốc với tốc độ chậm, lượng thuốc được hệ giải phóng khơng nhiều chỉ có 22,40% so với lượng thuốc được mang.
-Trong 6 giờ tiếp theo (thời điểm 12 giờ), lượng thuốc DOX được hệ giải phóng là 27,90% lượng thuốc được mang.
-Tại thời điểm 36 giờ, tổng lượng thuốc DOX được hệ giải phóng là 32,30 % lượng thuốc được mang.
-Trong khoảng 12 giờ đến 48 giờ, hệ có dấu hiệu giải phóng thuốc ít dần vì chỉ giải phóng thêm 5,30%.
-Tại thời điểm 72 giờ, tổng lượng thuốc giải phóng ra là 33,30% lượng thuốc được mang. Nhận thấy rất rõ, so với các thời điểm trước thì q trình giải phóng thuốc bắt đầu yếu dần đi. Kết quả giải phóng DOX như thế đạt mục tiêu là hệ biến tính mang thuốc giải phóng chậm tại mơi trường 7,4
Khảo sát thời gian 6 giờ đầu, hệ giải phóng thuốc được 22,77%, lượng thuốc được hệ pH 4,5 giải phóng khá nhiều so với hệ pH 7,4 chênh lệch 31,10 %.
-Trong một giờ đầu tiên nghiên cứu tiến hành lấy mẫu 3 lần lượng thuốc trung bình giải phóng là 22,77 %.
-Trong giờ thứ 2 nghiên cứu cũng tiến hành lấy mẫu 3 lần lượng thuốc trung bình giải phóng có tăng hơn so với 1 giờ đầu là 35,90%. Tương tự, ở giờ thứ 3 lượng thuốc giải phóng là 44,70%. Tổng lượng thuốc hệ giải phóng trong 6 giờ đầu tương đối nhiều khoảng 53,50 % lượng thuốc được mang trong hệ.
-Tại thời điểm 6 giờ tiếp theo tức là từ 6 giờ đến 12 giờ, nghiên cứu cũng tiến hành lấy mẫu 3 lần với lượng thuốc được hệ giải phóng là 65,80 % lượng thuốc được mang. Tại thời điểm này lượng thuốc được hệ giải phóng khá tốt
-Tại 36 giờ tiếp theo, tổng lượng thuốc được hệ giải phóng là 74,30% lượng thuốc được mang. Như vậy trong khoảng 12 giờ đến 48 giờ, hệ có dấu hiệu giải phóng thuốc tăng lên.
-Tại thời điểm 72 giờ, tính tới tại thời điểm này thì tổng lượng thuốc giải phóng là 75,07 % lượng thuốc được mang. Nhận thấy rất rõ, so với các thời điểm trước thì q trình giải phóng bắt đầu tăng đều vừa phải cao nhất ở 96 giờ là 75,09%.
- Từ số liệu cho thấy, ở môi trường pH 7,4 hệ PNS-APTES-GEL-mPEG (hệ được biến tính bởi Gelatin-mPEG) giải phóng thuốc DOX yếu hơn hệ đó ở pH 4,5.Vậy phù hợp với tiêu chí hạn chế giải phóng thuốc trong mơi trường trung tính pH 7,4 (tế bào lành) và giải phóng khá cao trong mơi trường acid 4,5 (mơi trường gần với tế bào ung thư).
Bên cạnh đó chúng tơi cũng so sánh khả năng giải phóng DOX của hệ PNS chưa biến tính và hệ PNS- GEL-mPEG tại pH 7,4 để thấy rõ hơn giá trị của việc biến tính.
Bảng 3.20. So sánh khả năng giải phóng DOX của hệ PNS và PNS- GEL-mPEG ở pH 7,4
Thời gian giải phóng (giờ) Tỷ lệ giải phóng (%)
pH = 7,4 pH = 4,5 0 0 0 1 7,30 8,97 2 12,40 - 3 17,00 42,77 6 22,40 58,72
12 27,90 66,50 24 30,06 74,06 36 32,30 79,30 48 33,20 83,73 60 - 84,02 72 33,30 75,09 84 33,30 75,09 96 33,30 75,09
Hình 3.39. Đồ thị so sánh khả năng giải phóng DOX của PNS và PNS-GEL-mPEG tại pH 7,4
Nhận xét
Qua đồ thị so sánh khả năng giải phóng DOX của chất mang PNS chưa biến tính và chất mang PNS-APTES-GEL-mPEG ta nhận thấy tại mơi trường pH 7,4 (môi trường tế bào lành) hệ nano silica xốp chưa biến tính (PNS) giải phóng DOX khá nhiều khơng đạt mục tiêu là chất mang thuốc phải bảo vệ thuốc lưu thơng trong hệ tuần hồn máu đến đúng mục tiêu là tế bào ung thư (pH khoảng 4÷5) mới được giải phóng. Từ đó cho thấy việc biến tính PNS là rất có ý nghĩa.
3.3.7. Kết quả mang và giải phóng của hệ PNS@CS-PEG
3.3.7.1. Kết quả mang thuốc DOX của PNS@CS-PEG
Sau khi đo UV vis lượng thuốc tự do chưa mang được, ta có kết quả như sau: Hiệu suất tải thuốc (DLE): 57,81 ± 1,45%
Nhận xét
Sau khi biến tính bằng CS-PEG ta nhận thấy hiệu quả mang thuốc tăng lên so với hệ PNS chưa biến tính nhưng vẫn tuy nhiên vẫn thấp hơn so hệ PNS-GEL-mPEG đã thực hiện trước đó. Điều đó có thể lý giải ngồi ưu diểm tạo liên kết imine kép với DOX gelatin cịn có cấu trúc mạch dài có thể bao thuốc bên trong.
3.3.7.2. Kết quả giải phóng DOX của PNS@CS-PEG
Sau khi khảo sát khả năng giải phóng DOX của chất mang PNS@CS-PEG trong hai mơi trường trung tính và acid ta có bảng số liệu như sau:
Bảng 3.21. Dữ liệu cho thấy khả năng giải phóng thuốc DOX của hệ PNS@CS-PEG ở pH=7,4 và pH=4,5
Thời gian giải phóng (giờ) Tỷ lệ giải phóng thuốc (%)
pH = 7,4 pH = 4,5 0 0 0 1 19,92 37,53 3 31,22 55,69 6 35,56 65,29 12 38,59 69,95 24 39,07 72,42 30 39,66 74,06 36 39,79 74,33 48 40,09 74,21 72 41,47 75,57 96 42,28 76,73
Trong tổng cộng 6 giờ đầu chất mang giải phóng 65,29% lượng thuốc được mang trong hệ PNS@CS-PEG ở môi trường pH 4,5. Cũng trong 6 giờ đầu nhưng trong mơi trường pH 7,4 lượng thuốc phóng tích là 35,56%. Vậy bước đầu cho thấy thuốc giải phóng tốt trong mơi trường pH 4,5 (gần giống với pH của tế bào ung thư).
Trong khoảng từ 6 giờ đến 96 giờ chất mang giải phóng được 76,73 % tại pH 4.5 trong khi tại pH 7,4 thì 42,28%. Ta thấy, thuốc sẽ giải phóng nhiều ở điều kiện pH 4.5 (gần giống pH của tế bào ung thư). Bên cạnh đó, chất mang PNS@CS-PEG cịn có liên kết disulfide liên kết này rất bền trong mơi trường trung tính (mơi trường tế bào lành) nhưng trong môi trường của tế bào ung thư thì hàm lượng gluthathione cao rất nhiều sẽ phá vỡ cầu nối SS giải phóng tại tế bào ung thư một cách hiệu quả [93, 94].
Các hệ biến tính PNS tạo ra các chất mang thuốc 1 (PNS-GPTMS-Hydrazine), chất mang thuốc 2 (PNS-GPTMS-CS-mPEG), chất mang thuốc 3 (PNS-APTES), chất mang thuốc 4 (PNS-APTES-COOH-GE), chất mang thuốc 5 (PNS-GEL-mPEG) đều giữ chặt thuốc 5-FU trong hệ do tương tác tĩnh điện giữa thuốc và chất mang và không giải