Mẫu phân sau khi đã đông khô được nghiền mịn trong các bình xay bằng nhựa với máy xay Osterizer. Các mẫu thu thập trong cùng một ngày có thể trộn chung và nghiền cùng nhau, đảm bảo rằng các mẫu được trộn đều trong máy xay trước khi chuyển mẫu ra giấy nến và chuyển vào trong bình. Phải đảm bảo tất cả các mẫu trong hộp chứa được chuyển hết vào trong bình xay. Mẫu sau khi nghiền được chuyển ra giấy nến, sau đó chuyển vào các bình Nalgen mới (đã được cân từ trước), tiến hành phá mẫu sử dụng lị vi sóng.
Cân mỗi mẫu (từ 0,1 – 0,2g) và chuyển vào các bình Teflon, thêm 4,0 ml HNO3 đặc. Đóng nắp ống và đưa vào lị vi sóng. Tiến hành phá mẫu khoảng 40
phút với thông số 600W, 25% công suất lớn nhất, tăng nhiệt độ tới 115 độ C trong 10 phút, giữ ở nhiệt độ này trong 30 phút. Sau khi hoàn tất phá mẫu, để mẫu nguội trong 10 phút. Lấy mẫu ra khỏi lò vi song, định mức bằng nước deion đến 50 ml. Đậy chặt nắp và lắc đều. Mỗi lần phá đều tiến hành mẫu blank (mẫu trắng chỉ gồm axit và nước deion)
Cho bay hơi 10ml dung dịch mẫu vừa phá trên bếp gia nhiệt tới khô khô (trong tủ hút, ở nhiệt độ 150 độ C, khoảng 2h) trong bình Teflon 50 mL đã được rửa acid, cẩn thận không làm cháy mẫu, đậy mẫu bằng đĩa Pyrex. bay hơi hết tới khô. Để nguội và thêm vào mẫu 10mL HCl 2,5M.
Mẫu phân tích chứa Zn2+
được làm sạch khỏi nền mẫu đi kèm bằng cột sắc ký chứa nhựa AG1-X8 như mẫu nước tiểu vá huyết tương ở trên.
Cơng thức tính hàm lượng đồng vị kẽm trong mẫu phân như sau:
1 ( / ) F F C V Zn g g n a
Trong đó: CF là nồng độ mẫu thực phân tích trên ICP – MS (ppb) V1 thể tích mẫu sau xử lý, phân tích trên ICP-MS (lít) aF khối lượng mẫu phân xử lý (g)
n: độ pha loãng trong quá trình xử lý mẫu (n = 50)
2.3.2.4. Phân tích tổng hàm lƣợng kẽm và đồng vị kẽm bằng trong viên thuốc kẽm
Bệnh nhân nhi đang điều trị lao được uống bổ sung viên kẽm (sản xuất từ muối kẽm gluconat hoặc kẽm sunfat và phụ gia có hàm lượng dự kiến ban đầu là 10 mg Zn/viên.
Lấy 10 viên thuốc, bỏ vỏ bọc bên ngoài, cân tổng khối lượng thuốc có trong 10 viên (m1 gam). Cân khối lượng tương ứng với 1 viên thuốc (m2 gam), thêm HNO3 1 %, rung siêu âm đến khi thuốc tan hoàn toàn và định mức thành 50 ml. Tiến hành phân tích bằng hai phương pháp AAS và ICP – MS.
Cơng thức tính tổng hàm lượng kẽm 2 1 700 ( ) m Zn mg m
m2 là khối lượng của một viên thuốc đem đi phân tích (g) 700 là hàm lượng kẽm có trong 10 viên thuốc
Cơng thức tính các đồng vị kẽm từ nồng độ Cx theo phương trình đường chuẩn là: 1 50 ( / ) 1000 x C Zn mg kg m
Trong đó: Cx là nồng độ mẫu phân tích tính theo phương trình đường chuẩn m1 là lượng cân mẫu thuốc đem đi xác định
50 là thể tích định mức sau khi đã xử lý mẫu
2.3.3. Phƣơng pháp thống kê xử lý số liệu phân tích
2.3.3.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng đồng vị
Giới hạn phát hiện là nồng độ của chất phân tích tương ứng với tín hiệu đo nhỏ nhất mà thiết bị có thể phát hiện được (định tính).
Giới hạn định lượng là nồng độ của chất phân tích tương ứng với tín hiệu đo nhỏ nhất mà thiết bị có thể xác định được (định lượng).
Đối với thiết bị quang phổ plasma ICP – MS [3], giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của đồng vị được tính theo các cơng thức sau:
3.Sb LOD b ; 10.Sb LOQ b
Trong đó: LOD là giới hạn phát hiện đồng vị (Limit of Detection)
LOQ là giới hạn định lượng đồng vị (Limit of Quantification)
b
S là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng
b là hệ số góc của đường chuẩn xác định đồng vị. Đo lặp mẫu trắng 10 lần, tính Sb theo cơng thức sau
2 1 ( ) 1 n i i b x x S n
x là giá trị trung bình tín hiệu mẫu trắng của n lần đo lặp; n là số lần đo lặp mẫu trắng
2.3.3.2. Khoảng tuyến tính của phép đo đồng vị
Trong phép đo ICP – MS [15], việc định lượng một đồng vị dựa vào phương trình cơ bản
b ms
I KC
Trong đó: Ims là cường độ tín hiệu của vạch phổ.
K là hằng số thực nghiệm. C là nồng độ của đồng vị b là hằng số (0 b 1).
Trong khoảng nồng độ nào đó b có giá trị bằng 1, mối quan hệ giữa Imsvà
C là tuyến tính:
ms
I KC
Khoảng nồng độ bắt đầu từ giới hạn định lượng (LOQ) đến giới hạn tuyến tính (Limit Of Linearity – LOL) được gọi là khoảng tuyến tính của phép đo đồng vị cần phân tích. Khoảng tuyến tính của mỗi đồng vị có tỷ số m/z khác nhau là khác nhau.
Để xác định khoảng tuyến tính của phép đo đồng vị cần thiết lập đường chuẩn xác định đồng vị. Tuy nhiên, phương pháp ICP –MS tín hiệu của phép đo có thể thay đổi trong khoảng giá trị rất lớn nên khoảng tuyến tính của phép đo rất rộng (từ vài ppt cho đến vài chục hay vài trăm ppm). Do đó, đối với phép đo quang phổ plasma ICP – MS không cần chú ý nhiều đến giới hạn tuyến tính.
Thiết lập đường chuẩn xác định đồng vị bằng dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng phù hợp, nồng dộ thấp nhất của đồng vị trong dung dịch chuẩn không nhỏ hơn giới hạn định lượng của đồng vị đó. Phải đảm bảo độ chính xác của phép đo ở mọi khoảng nồng độ của đường chuẩn, mỗi phép đo được thực hiện lặp lại 3 lần. Sau đó sử dụng đường chuẩn được thiết lập để xác định nồng độ của đồng vị trong dung dịch chuẩn kiểm tra. Đánh giá độ chính xác của phép đo qua kết quả tính tốn độ chệch và độ lệch chuẩn tương đối của
2.3.3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
Từ kết quả nghiên cứu thu được, tiến hành xây dựng phương pháp phân tích đồng vị kẽm trong các mẫu huyết tương, mẫu nước tiểu và mẫu phân sau đó đánh giá phương pháp qua thơng số như độ chính xác và độ thu hồi.
*Đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp phân tích
Độ chính xác của phương pháp phân tích bao gồm độ đúng và độ chụm [4] - Đánh giá độ đúng của phép phân tích qua độ lệch chuẩn (B) giữa giá trị kết quả
phân tích SRM và giá trị đã được chứng nhận. Độ chệch kết quả phân tích được
(%) SRM 100 SRM X X B X
- Đánh giá độ chụm của phép phân tích qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD), được tính như sau: (%) SD 100 RSD X Trong đó: B là độ chệch
RSD là độ lệch chuẩn tương đối (%)
X là lượng đồng vị xác định được (giá trị trung bình)
SRM
X là lượng đồng vị được chứng nhận (giá trị trung bình) SD là độ lệch chuẩn, được tính theo cơng thức sau:
2 1 ( ) 1 n i i X X SD N
Trong đó: Xilà lượng đồng vị xác định được lần thứ i N là số lần thí nghiệm
Thêm một lượng nhất định đồng vị cần xác định vào mẫu phân tích, tiến hành xử lý mẫu qua tất cả các bước theo quy trình phân tích, so sánh kết quả phân tích hàm lượng đồng vị trong mẫu sau khi được thêm vào đồng vị và kết quả phân tích hàm lượng đồng vị trong mẫu ban đầu.
Hiệu suất thu hồi được tính theo cơng thức sau:
(%) total sample 100 Spike C C R C
Trong đó, R là hiệu suất thu hồi (%);
Spike
C : Lượng đồng vị thêm vào mẫu
sample
C : Lượng đồng vị có trong mẫu ban đầu
total
C : Tổng lượng đồng vị xác định được trong mẫu sau khi
thêm dung dịch chuẩn.
Sau khi đã kết luận được độ chính xác của phương pháp phân tích, áp dụng quy trình phân tích để xác định đồng vị kẽm trong các mẫu huyết tương, mẫu nước tiểu và mẫu phân .
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp trên thiết bị ICP-MS 3.1.1. Khảo sát và lựa chọn các tham số tối ƣu của thiết bị đo 3.1.1. Khảo sát và lựa chọn các tham số tối ƣu của thiết bị đo
Phép đo các đồng vị kẽm trong mẫu sinh học và đánh giá sự biến đổi hàm lượng của các đồng vị được tiến hành với cả 5 đồng vị 64
Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn, 70Zn. Vì vậy cần tìm điều kiện tối ưu có thể phân tích đồng thời 5 đồng vị này thông qua việc đánh giá sự phụ thuộc cường độ tín hiệu (CPS) của phép đo vào các tham số hoạt động plasma sao cho đạt được độ nhạy tốt và độ ổn định cao (RSD nhỏ).
3.1.1.1. Ảnh hƣởng của thế thấu kính
Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của cường độ tín hiệu phép đo hay số đếm (CPS) Zn vào RFP khi xác định các đồng vị 64
Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn, 70Zn được trình bày từ hình 3.1 đến hình 3.5. (xem thêm trong phụ lục P1.6 đến P1.20).
Khi cố định tốc độ bơm mẫu (PR) là 26 vịng/s, lưu lượng khí mang argon (NGF) là 0,7 lit/phút và thay đổi lần lượt thế thấu kinh ion từ 3V đến 9V thì cường độ tín hiệu thu được khi đo riêng rẽ 5 đồng vị kẽm phụ thuộc vào công suất máy phát cao tần được biểu diễn trong các hình từ 3.1 đến 3.5.
Hình 3.2. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 66
Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)
Hình 3.3. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 67
Hình 3.4. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 68Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)
Hình 3.5. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 70
Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)
Kết quả biểu diễn sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị kẽm vào cơng suất cao tần (RFP) khi lượng khí mang (NGF) là 0,7 L/ph từ hình 3.1 đến hình 3.5 cho thấy đối với phép đo các đồng vị 64
tín hiệu tăng dần khi RFP tăng từ 900 đến 1400W (so với giới hạn cho phép của thiết bị đo là 1500W) do khả năng ion hóa mẫu cũng tăng, số lượng ion M+
hình thành tăng. Thế thấu kính ion càng lớn thì sự tăng tín hiệu khi cơng suất máy phát cao tần tăng càng nhanh, kèm theo tín hiệu kém ổn định hơn. Tuy nhiên, cường độ tín hiệu các phép đo đồng vị 66
Zn, 68Zn lại ít thay đổi . Vì hàm lượng đồng vị 70
Zn trong mẫu rất nhỏ nên để tăng độ nhạy của phép đo chúng tơi lựa chọn thế thấu kính ion là 9V (lớn nhất có thể của máy đo) để cường độ tín hiệu phép đo cả 5 đồng vị kẽm với các thông số khác nhau đều thu các giá trị là cao nhất.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cơng suất cao tần đến tín hiệu đo khi thay đổi lưu lượng khí mang là 0,8; 0,9 và 1,0L/phút (các hình P1.6 đến P1.20) cũng cho thấy qui luật biến thiên cường độ tín hiệu phép đo của các đồng vị 64
Zn, 67Zn và 70Zn tăng tuyến tính theo RFP, còn đối với các đồng vị 66Zn và 68Zn thì cường độ tín hiệu phép đo phổ thay đổi khơng đáng kể. Qui luật biến thiên tín hiệu này cũng không khác so với khi NGF là 0,7 L/phút.
3.1.1.2. Ảnh hƣởng của lƣu lƣợng khí mang mẫu (NGF)
Dựa theo kết quả khảo sát ảnh hưởng của công suất máy cao tần (Phần
3.1.1.1) đến cường độ tín hiệu phép đo phổ Zn với các giá trị NGF khác nhau tại
các vị trí thế thấu kính khác nhau đã xác định được với giá trị thế thấu kính LV = 9V cho cường độ tín hiệu phép đo là lớn nhất. Do đó trong phần này chúng tơi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng khí mang NGF đến cường độ tín hiệu phép đo phổ các đồng vị Zn tại vị trí thế thấu kính LV = 9Volts nhằm mục đích tìm ra giá trị lưu lượng khí mang tối ưu nhất cho phép đo.
Kết quả khảo sát sự phụ thuộc cường độ tín hiệu của phép đo vào NGF khi xác định các đồng vị 64
Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn, 70Zn được trình bày ở các hình từ Hình P2.1 đến Hình P2.5.
Đối với hai đồng vị 66
Zn và 68Zn (hình P2.1 và P2.2) khi thay đổi lưu lượng khí mang NGF từ 0,6 – 0,9 L/ph thì cường độ tín hiệu phép đo phổ tăng dần lên, nhưng khi lưu lượng khí mang lớn hơn 0,9 L/ph thì cường độ tín hiệu phổ bắt đầu giảm. Trên đồ thị cho thấy tại NGF = 0,9 L/ph thì cho cường độ tín hiệu phép đo phổ đồng vị 66
Zn và 68Zn đạt cực đại. Do vậy chúng tôi chọn lưu lượng khí mang NGF = 0,9 L/ph và vị trí thế thấu kính LV = 9Volts khảo sát để xác định giá trị công suất cao tần RFP tối ưu cho phép đo phổ đồng vị 66
Kết quả khảo sát từ hình P2.3 đến hình P2.5 của các đồng vị 64
Zn, 67Zn và 70Zn cho chúng ta thấy khi thay đổi lưu lượng khi mang NGF từ 0,6 – 1,0 L/ph thì cường độ tín hiệu phép đo phổ Zn giảm dần. Với NGF = 0,6 L/ph thì cường độ tín hiệu phép đo phổ các đồng vị 64
Zn, 67Zn và 70Zn cho giá trị lớn nhất. Do vậy chúng tơi chọn lưu lượng khí mang NGF = 0,6 L/ph và vị trí thế thấu kính LV = 9V để tiến hành khảo sát công suất cao tần đối với phép phân tích các đồng vị 64
Zn, 67Zn và 68Zn.
3.1.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của công suất cao tần khi cố định LV và NGF
Để xác định công suất cao tần tối ưu cho các phép đo phổ các đồng vị Zn, trong phần này chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo phổ vào công suất cao tần RFP cụ thể cho từng đồng vị Zn như sau:
Hình 3.6. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị Zn vào RFP
Để xác định công suất cao tần tối ưu cho phép đo 2 đồng vị 66
Zn và 68Zn chúng tôi lựa chọn NGF = 0,9L/ph và LV = 9 Volts (là giá trị tối ưu đã được
xác định theo phần 3.1.1.1 và 3.1.1.2). Kết quả khảo sát đồ thị hình P2.6 cho
thấy khi công suất cao tần tăng từ 900 - 1200 cường độ tín hiệu phép đo tăng điều này có thể giả thích là do khi năng lượng tăng sự hình thành ion của phép đo tăng do đó cường độ tín hiệu phép đo tăng theo. Nhưng khi cơng suất tăng vượt quá 1200W cường độ tín hiệu phép đo giảm dần nguyên nhân do năng lượng cao dẫn đến sự hình thành nhiều loại ion không mong muốn làm giảm lượng ion của phép đo do vậy cường độ tín hiệu phép đo phổ giảm. Cường độ
tín hiệu phép đo đạt cực đại khi RFP = 1200W. Sau khi đã khảo sát các như trên, chúng tôi chọn NGF = 0,9L/ph, RFP = 1200W và LV = 9 Volts cho phép đo phổ xác định 2 đồng vị 66
Zn và 68Zn.
Biểu diễn sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo phổ 64
Zn, 67Zn và 70Zn theo công suất cao tần RFP khi NGF = 0,6L/ph (là lưu lượng khí mang tối ưu đã khảo sát ở mục 3.1.1.2) ở hình 3.7 ta thấy, khi tăng cơng suất cao tần từ 900 – 1400W cường độ tín hiệu phép đo phổ Zn tăng dần. Điều này có thể giải thích khi cố định lưu lượng khí mang và thế thấu kính tăng cơng suất cao tần làm tăng sự hình thành ion của phép đo do đó cường độ tín hiệu phép đo tăng theo. Cường độ tín hiệu phép đo lớn nhất khi RFP = 1400W. chúng tôi chọn NGF = 0,6L/ph, RFP = 1400W và LV = 9 Volts cho phép đo phổ xác định 2 đồng vị 64
Zn, 67Zn và 70Zn.
Hình 3.7. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị Zn vào RFP
Nếu so sánh cường độ tín hiệu tại công suất cao tần lớn nhất có thể là