Tron p n p áp này, các dung dịch methanol chuẩn đã đ điều chế, sau đó đ c oxy hóa bởi kali p rman anat đ tạo thành formaldehyde. Trong một nghiên cứu tr ớ đ y, đ ờng uẩn làm vi đ c tạo ra bởi bộ dung dịch methanol chuẩn với nồn độ 7,91; 31,66; 39,57; 47,48 và 74,19 mg/L [41]. Sodium pyrosulfit đã đ c thêm vào đ ó đ c dung dịch khơng màu, sau đó sử dụng acid romotropi đ tạo phản ứng màu với formaldehyde. Sau đó, quang phổ UV-VIS đ c sử dụn đ đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn từ đó rút ra đ ờn on ấp t ụ và àm l n m t anol t o p n p áp đ ờn uẩn.
P n p áp này ó iới hạn phát hi n là 1,0 mg/L, độ l ch chuẩn t n đối lớn nhất là 2,41%, hi u suất thu hồi 97,8 ~ 104,5%, cho thấy p n p áp ó độ chính xác đáp ứn đ yêu ầu p n t [41].
Tá iả McCreery v ộn sự [38] đã sử dụn p n p áp này đ p n t m t anol tron một số sản p ẩm t ảo d . t anol đ oxi óa đ tạo t àn formaldehyde ằn kali p rman anat 3% tron môi tr ờn axit p otp ori 15%. Sau đó, formaldehyde p ản ứn với dun dị axit romotropi 5% đ tạo p ứ ở 600C. p ất màu đ đo ở 575nm.
CH3OH + MnO4- + H+ → C + n2+ + H2O nHCHO + m(HO)2C10H4(SO3H)2 → p ứ
Nồn độ m t anol, t anol tron đồ uốn ó ồn đ tá iả M unov v
ộn sự [39] sử dụn d ydro nas nzym (A ) và oxidas (A ) là ất xú
tá o quá trìn oxi óa r u t àn and yd . Sản p ẩm ủa quá trìn này sẽ t am ia p ản ứn oxy óa ỉ địn với p-p nyl n diamin đ tạo p ất màu bandrowski (4-diamine-3,6- is(p-aminop nyl) imino) -4- y lo xadi n -1) và đo ở ớ són 540nm. Giới ạn p át i n ủa p n p áp đối với t anol là 9 µmol và m t anol là 0 9 µmol/L.
N ồi axit chromotropic n t uố t ử k á n sử dụn Natri Nitroprusside. Hydroxyl có có th phản ứng với natri nitroprussid đ tạo thành ion [Fe(CN)5NO(OH)]3-(thành phần của thuốc thử tạo màu (SNP)).
OH- + [Fe(CN)5NO]2- → [ (CN)5NO(OH)]3-
Trong dung dịch kiềm, CH3O- đ c hình thành bằng cách ion hóa CH3OH: CH3OH + OH- → C 3O- + H2O
Sau đó [Fe(CN)5NO(CH3O)]3- đ c hình thành do phản ứn trao đổi giữa OH- của [Fe(CN)5NO(OH)]3- và CH3O-:
[Fe(CN)5NO(OH)]3- + CH3O- → [ (CN)5NO(CH3O)]3- + OH-
Tron p n p áp này một hỗn h p natri nitroprusside, kali ferricyanide và natri ydroxit đã đ c tạo ra đ điều chế thuốc thử tạo màu (SNP). Sau đó dun dịch chuẩn đ c chuẩn bị bằng cách giữ o l n SNP k ôn đổi và l ng
m tanol đ t ay đổi dần dần. Độ l ch chuẩn t n đối o p n p áp này là 1,5% và giới hạn phát hi n là 12 mg/L.
Đ y là một p n p áp tốt đ xá định methanol, với giới hạn phát hi n thấp và độ chính xác cao.
1.2.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại gần (NIR)
P n p áp p ổ ồn n oại kết p với ồi quy đa iến đ sử dụn đ đán iá một số t àn p ần tron đồ uốn ó ồn. P n p áp dựa trên sự ấp t ụ n l p ổ ồn n oại ủa á p ất óa . Sau k i ấp t ụ ứ xạ ồn n oại, á p n tử ủa p ất óa dao độn với tần số k á n au, từ đó xuất i n p ổ ấp t ụ ồn n oại đặ tr n o từn p ất. t anol ó tần số dao độn 1020 m-1 đến 1112 m-1, t anol từ 1047 m-1 đến 1987 m-1 [18].
Gabriele Reich [23] cho thấy vùng NIR của phổ đi n từ ó ớc sóng 780-
2526 nm t n ứng với dải sóng 12820-3959 cm-1
. Các dải hấp thụ nổi bật nhất xảy ra tron vùn N R ó liên quan đến các cực âm và các nhóm –CH, -NH, -OH.
Trong một nghiên cứu tr ớ đó, Heitor L. Fernandes và các cộng sự [26] sử dụng một quang phổ kế FT-NIR cung cấp một cuvet dịng chảy ó đ ờng kính 10mm và khối l ng bên trong 80 μ đ c sử dụn đ t u đ c phổ từ 14000 đến 4000 cm-1 (714 và 2500 nm), với độ phân giải 8 cm-1. Các mẫu thực tế đ c sử dụng là xăn . ột bộ đ c tạo thành bởi 120 mẫu chứa methanol và ethanol, đều ở nồng độ từ 0 đến 30% (v v) vào xăn k ôn ứa cồn. Cá đ ờng cong hi u chuẩn sử dụng PLS-1 (hi u chuẩn riêng cho methanol và ethanol) và PLS-2 (đồng thời hi u chuẩn cho cả ai) đ c xây dựng. Các kết quả đ c so sánh với các giá trị của hàm l n m t anol đ xá định bằn p n p áp uẩn. Tất cả các kết quả thu đ c nằm trong khoảng sai số t n đối ± 4% (trừ mẫu 12), đ c chấp nhận đ xác địn m t anol tron xăn .
1 2 4 Phương pháp điện hóa
Tron p n p áp vol – amp v n , t ế đi n ự làm vi đ tăn tuyến t n t o t ời ian [43]. Đi n t ế đ đo iữa đi n ự làm vi và đi n ự so sán , d n đi n đ đo iữa đi n ự làm vi và đi n ự đối.
t anol ó t đ oxy óa ở á đi n ự vàn tron dun dị kiềm t àn and yd oặ format ( < 1,0 V) và ở đi n t ế ao n 1,0 V t àn a on dioxid oặ a onat [16]. Cá d n oxy óa ao n ất t ờn đ quan sát t ấy tron á dun dị kiềm.
Sousa và các cộng sự sử dụn p n p áp vol – ampe vòng với đi n cực làm vi c Pt –Au xá địn đồng thời methanol và ethanol trong nhiên li u ethanol. an đầu, k oản tuyến t n đ t ự i n ằn á sử dụn á dun dị uẩn ỉ ứa t anol oặ m t anol và t anol o t ấy độ tuyến t n tốt tron k oản nồn độ n iên ứu (0,1 – 0,5%). Cá mẫu t ự sau đó đ p n t sau k i p a loãn dun dị đi n p n ứa 0,5 mol/L NaOH 0,1% (v/v) methanol [46]. t anol ó t đ p át i n n l tại +0,19 V, giới hạn phát hi n 0,028%. Methanol đ p át i n ở đi n t ế (+1,20 V). Độ l uẩn t n đối (n = 8) là 0,9%, iới ạn p át i n ( ) ủa m t anol là 0,045% (v/v).
Đ tách methanol và ethanol ra khỏi dầu diesel sinh h c, Shihov và các cộng
sự [11] sử dụng 1 module thấm i (VP ) với 1 màng polymer poly (phenylene
isophtalamide) (PA) chứa dung môi d . Sau k i ố i vào k oan VP , m t anol và t anol đ c vận chuy n thông qua màng PA tới buồng trộn đ c trang bị một d t tor đo t ế. Giới hạn phát hi n với cả 2 chất là 0,02%.
1 3 ác phương pháp ử l mẫu sinh học ph n t ch methanol và ethanol
Tron mẫu máu ln có tỉ l lớn các protein và các chất nội sinh làm cản trở gây ảnh h ởng tới khả năn p át i n chất p n t . o đó, mẫu cần phải đ c chiết tách, xử lý đ loại bỏ các tạp chất. Đặc bi t tron p n t định tính methanol, do protein có chứa các axit amin gây ảnh h ởng tới phản ứng oxy hóa
metanol thành fomandehit, làm sai l ch kết quả phân tích. Ph n p áp tủa protein dựa trên sự biến tính làm mất cấu trúc bâc 2 và bậc 3 của các protein có trong nền mẫu sinh h c. Các tác nhân gây tủa protein trong dịch sinh h c gồm nhi t độ, môi tr ờng axit mạn ay az , các dung môi hữu , các muối vô [45].
Kết tủa protein bằn á t ay đổi pH: mỗi protein sẽ có một đi m đẳn đi n (pI). Ở giá trị pH = pI, phân tử prot in trun a đi n sẽ không chuy n dịch trong đi n tr ờng, phân tử protein sẽ kém bền nhất và dễ bị kết tủa, các tác nhân gây tủa prot in do t ay đổi p t ờn là á axit n tri loroax ti axit (TCA) ở nồn độ 2-5% và axit percloric ở nồn độ 15% so với l ng mẫu. P n p áp tủa protein bằn axit đ c áp dụng cho những hoạt chất dễ tan tron n ớc và bền với acid[46] . Ngồi ra, ũn ó t kết tủa protein bằng các polyme không ion hoặc các ion kim loại hoặc loại bỏ protein và các phân tử có khối l ng lớn bằng ph n pháp siêu l c [21]. Tủa protein bằng dung mơi hữu : Độ hịa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là ằng số đi n môi của dung dịch. Những phân tử dung mơi có hằng số đi n môi lớn nh n ớc có th ổn định t n tá iữa chúng với các phân tử protein và tạo điều ki n thuận l i cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ng c lại, các dung môi với hằng số đi n môi nhỏ nh acetonitril, khi có mặt trong mẫu ún n ăn ản sự phân tán của các phân tử protein trong môi tr ờng làm giảm độ hòa tan của các protein và xảy ra kết tủa. Tủa protein bằng muối vô , một số muối nh (NH4)2SO4, NaCl… vừa làm trung a đi n vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein gây ra hi n t ng keo tụ.
Ph n p áp tủa protein thông th ờng sử dụn tri loroax ti axit đ c cải tiến [57] bằng cách sử dụn 10% TCA a ton đ loại các albumin có trong huyết thanh, ph n p áp rất nhanh chóng loại đi l ng lớn các albumin. Nghiên cứu t n tự ũn đ c Haudenschild và các cộng sự công bố năm 2014 [19].
T ả Jiang và các cộng sự [36] đã so sánh 5 ph n p áp sử dụn đ kết
tủa protein. Tác giả đã sử dụng TCA 60%, Acetonitril, (NH4)2SO4, chloroform/ metanol và ph n p áp siêu l đ loại bỏ protein. Kết quả đo đi n di gel 2 chiều
cho thấy, sự kết tủa với TCA và acetonitril và ph n p áp siêu l c hi u quả t n đ n với nhau tại cùng nồn độ mẫu và có th khử muối. Vi c sử dụng (NH4)2SO4 từng phần hi u quả đ bỏ albumin, chiếm n 50% prot in uyết t n .
T n tự nh nghiên cứu trên, Nejadi và các cộng sự [40], ũn đã so sán 3 ph n p áp t ôn t ờng loại bỏ protein là sử dụng acetonitril, TCA/ rửa aceton và TCA/aceton. Kết quả cho thấy, sử dụng acetonitril kết tủa thì ổn địn và đ n giản n 2 p n p áp n lại.
1.4. ổng ết chung phần tổng quan
Tóm lại tổng quan tài li u tham khảo cho thấy có rất nhiều p n p áp ó th đ c áp dụn đ xá định methanol, ethanol trong nhiều chất nền. Có th dùng p n p áp quan p ổ đi n hóa và sắ ký đ xá định nồn độ methanol, ethanol trong huyết t n trầm t i n, n ớc giải k át k ôn k n ớc... Trong nghiên cứu này, chúng tôi ch n p n p áp sắ ký k với d t t r đ xá địn đồng thời methanol và ethanol trong huyết t n n ời. Đ y là p n p áp ó độ n ạy và độ n xá ao n so với á p n p áp k á .
Tron mẫu máu ln có tỉ l lớn các protein làm ản ởng tới khả năn phát hi n chất phân tích. Protein có chứa các axit amin gây ản ởng tới phản ứng oxy hóa methanol thành fomandehit, làm sai l ch kết quả phân tích. o vậy mẫu ần đ loại ỏ prot in tr ớ k i tiến àn p n t . Có rất n iều p n p áp đ sử dụn đ kết tủa prot in tron đó sử dụn acetonitril kết tủa thì ổn định và đ n iản n ất. ởi vậy ún tôi đã sử dụn acetonitrile đ loại ỏ prot in tron mẫu uyết t n n ời.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Mẫu ph n t ch
Đ xây dựng và xác n ận giá trị sử dụng của p n p áp p n t đồng thời
MeOH và EtOH trong huyết t n n ời, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối t ng mẫu sau:
- ẫu trắn : là uyết t n n ời ủa vi n uyết và truyền máu trun n . - ẫu uẩn: là mẫu trắn đ t êm l n xá địn MeOH và EtOH tạo t àn
mẫu.
- ẫu t ử: là uyết t n n n n n ộ độ MeOH, EtOH t u đ từ mẫu máu, ly t m lấy p ần uyết t n .
S l c về máu:
* Máu chiếm khoảng 7-9% khối l n t , một n ời trung bình có 4-5 lít máu (khoảng 75-80ml/kg).
* Máu có 2 thành phần chính là huyết cầu (chiếm khoảng 40%) và huyết t n ( iếm khoảng 60%).
- Huyết cầu gồm: Hồng cầu, bạch cầu và ti u cầu
- Huyết t n là dun dịch chứa đến 96% là n ớc, 4% là các protein huyết t n và rất nhiều chất khác với l ng nhỏ: Các hormone; các protein khác; các chất thải của t ; các chất đi n giải n : Natri lo anxi kali p osp at …..
C uẩn ị mẫu uyết t ng:
- Mẫu máu toàn phần đ c lấy từ các b nh nhân ngộ độc methanol vào ống chứa chất chốn đôn ( parin).
- Mẫu này n ay sau đó đ c ly tâm 15 phút, 4000 vòng/phút. Phần huyết t n p a trên đ c lấy sang ống có nắp, l u tại -4o
C.
- 1ml mẫu huyết t n sẽ đ c xử lý loại protein bằng ACN, lấy dịch nổi đ phân t định l ng bằng ph n p áp GC-FID.
2.2. Chất chuẩn, ho chất, thiết bị
2 2 1 h t chuẩn
Chất chuẩn methanol, ethanol của hãng Merck (Germany) với độ tinh khiết t n ứng của methanol là (99,8%) và ethanol là (96%).
2.2.2 oá ch t
- N ớc cất sử dụn là n ớc cất hai lần đã đ c deion hoá.
- Chất nội chuẩn Isopropanol của hãng Merk với độ tinh khiết phân tích (>99%).
- Acetonitrile (ACN) của hãng Merk với độ tinh khiết phân tích (≥99,8%). - un dị chuẩn gốc MeOH 1g/l: Dùng micropipet hút 126µl methanol 99,8% (d = 0,792 ml) o vào ìn định mứ 100ml và định mức bằn n ớc cất đến vạch. Từ dung dịch trên ta trộn với á t t huyết t n trắn đ có nồn độ methanol 10-480 µ ml đ khảo sát và xác định giá trị sử dụng của p n p áp.
- Dung dịch chuẩn gốc EtOH 10g/l: Dùng micropipet hút 130µl ethanol 96% (d = 0,81 ml) o vào ìn định mứ 100ml và định mức bằn n ớc cất đến vạch.
Từ dung dịch trên ta trộn với á t t huyết t n trắn đ có nồn độ ethanol
100-3600 µ ml đ khảo sát và xá định giá trị sử dụng của p n p áp.
2 2 3 hiết bị, dụng cụ
Thi t bị
- Máy sắc kí khí GC- (T rmo S i ntifi ) đ c trang bị một phần mềm máy tính (Xcalibur), một cột mao quản TG-A C2 ( k t ớc 30m×0,32 mm id, độ dày của lớp film 1,2 μm).
- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ đ c của cân 0,0001 g. - B siêu âm, Model: S30/H, Hãng ELMA, Đức.
- Máy lắc xoáy model: 3005 của hãng GFL, Đức.
- Tủ sấy model: 500 của hãng Memmert, Đứ ó n i t độ 220oC.
- Máy cất n ớc hai lần. Model: A4000D/Aquatron hãng Stuart - Barloworld Scientific, 4 l/h, Anh.
- Bộ l n ớc siêu sạch, Model: WaterPro PS/HPLC/UF hybrid - Labconco. 115V, 60Hz, Mỹ.
- Tủ lạnh bảo quản mẫu.
- P ần mềm p n t minita 16 đ xử lý số li u. Dụng cụ
- Kim tiêm, ống nghi m đ thu và bảo quản mẫu.
- ìn định mức dung tích: 5, 10, 25, 50, 100ml; thủy tinh loại A. - Micropipet: 1-100μl; 100-1000μl; 1000-5000μl
- Ống nghi m lấy máu chứa EDTA và ống ly tâm chia vạch có nút xốy. - Giấy l c siêu mịn.
- Các dụng cụ phịng thí nghi m khác.
Tất cả các dụng cụ thủy tin đều phải đ c rửa sạch, tráng 3 lần bằn n ớc cất 2 lần, tráng lại bằn n ớc deion, sau đó sấy ở 150oC trong vòng 1 giờ, lấy ra đ nguội tr ớc khi sử dụng.
2.3. Phƣơng ph p nghiên cứu
2 3 1 Nghiên cứu dựng qu trình định lượng methanol. ethanol.
2 3 1 1 C uẩn ị m u uẩn
T o n t n ất đã iết của ancol, ancol có ai xu ớn a tan đối ch i n au là: xu ớng của nhóm -OH phân cự làm tăn t n a tan tron n ớc và xu ớng của chuỗi a on n ăn ản điều này. Vì vậy, methanol và ethanol dễ hịa tan
tron n ớc vì nhóm hydroxyl chiếm u t ế. ua đó, chúng tơi lựa ch n n ớ đ hịa tan methanol và ethanol vì n ớ k ơn độc hại, thân thi n với môi tr ờng.