Chương 2 Thực nghiệm
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát các điều kiện tối ưu của thiết bị ICP-MS
Khảo sát tìm điều kiện tối ưu: nồng độ của các thành phần pha động, pH của pha động, tốc độ dịng pha động, thể tích bơm mẫu, độ phân giải và thời gian lưu của các dạng Asen.
Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình xác định hàm lượng Arsen (III), monomethylarsonic acid (MMA), dimethylarsonic acid (DMA) và Arsen (V) trong nước tiểu của người.
Xây dựng qui trình phân tích xác định đồng thời bốn dạng As3+
, As5+, DMA và MMA trong nước tiểu của người, đánh giá độ đúng của phương pháp.
Khảo sát độ ổn định của các dạng asen vào thời gian bảo quản mẫu.
Tiến hành lấy mẫu và phân tích mẫu nước tiểu thực tế được lấy tại hai xã Chuyên Ngoại và Châu Giang huyện Duy Tiên tỉnh Hà Nam.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC-ICP-MS
Cơ sở của phương pháp nghiên cứu là dựa trên khả năng tách 4 dạng asen As3+, As5+, DMA và MMA trên cột sắc kí Hamilton PRP-X 100 250mm- 4,6mm I.D với pha động bao gồm 12,5mM (NH4)2HPO4; 3% MeOH v/v; pH: 8,0. Tốc độ dịng của pha động 1,2 mL/phút. Sau đó từng dạng asen đã tách được phân tích định lượng trên thiết bị ICP-MS. Đây là thiết bị có độ nhạy cao cũng như giới hạn phát hiện rất thấp và có độ lặp lại cũng như độ đúng tốt.
2.2.2.2. Lấy mẫu, bảo quản và phân tích mẫu nước tiểu trên thiết bị HPLC-ICP/MS.
Lấy mẫu và bảo quản mẫu: Mẫu được lấy trực tiếp từ các cá nhân rồi
chuyển vào ống nhựa PTFE hay PE sau đó bảo quản lạnh ở 40C và trong bóng tối vận chuyển về phịng thí nghiệm, phân tích ngay trong ngày, nếu khơng tiến hành phân tích ngay thì phải bảo quản ở -18oC.
Phân tích mẫu: Mẫu nước tiểu được đưa về nhiệt độ phịng thí nghiệm sau
đó được pha loãng 10 lần bằng dung dịch pha động (phần 2.1.1.c). Lắc trộn trên thiết bị Voltex-mix khoảng 1 phút, sau đó lọc dung dịch này qua màng lọc 0,45µm. Tiến hành bơm 100µL phần dịch lọc vào cột sắc kí của hệ thiết bị HPLC-ICP/MS, với pha động là: 12,5mM (NH4)2HPO4; 3% MeOH v/v pH: 8,0; Tốc độ dòng: 1,2
mL/phút.
2.2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
a) Phương pháp tìm điều kiện tối ưu: Để tìm điều kiện tối ưu cho phương pháp phân
tích chúng tơi sử dụng phương pháp đơn biến.
Nguyên tắc của phương pháp đơn biến: trong quá trình khảo sát chỉ thay đổi một yếu tố có ảnh hưởng đến kết quả đo và giữ cố định các yếu tố khác. Chọn điều kiện cho kết quả tốt nhất. tiếp tục khảo sát các yếu tố khác theo nguyên tắc trên.
b) Đánh giá phương pháp
Chúng tôi đánh giá phương pháp qua các thông số như: độ đúng, độ lặp lại, độ thu hồi, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và đường hồi quy tuyến tính của phương pháp.
Độ đúng của một phương pháp phân tích mơ tả sự gần nhau của kết quả trung bình các phép thử thu được từ quy trình phân tích với giá trị thực.
Cách tiến hành: Phân tích lặp lại 3 lần mẫu nước tiểu có chứa hàm lượng chất phân tích đã biết (mẫu CRM) rồi so sánh kết quả trung bình của 3 kết quả đo với giá trị thực.
Kết quả thực nghiệm được biểu diễn dưới dạng:
X ± 𝑡S 𝑁
Trong đó X là giá trị trung bình các giá trị thực nghiệm
t giá trị chuẩn student với độ tin cậy 95% và số bậc tự do N-1 N số lần làm thí nghiệm
S độ lệch chuẩn
Để đánh giá giá trị thực nghiệm có giống với giá trị thực hay khơng chúng tơi sử dụng chuẩn student để đánh giá:
Tính giá trị chuẩn student t theo cơng thức: tthực nghiệm = μ− X . N S Trong đó: µ là giá trị thực Sau đó so sánh giá trị tthực nghiệm với giá trị t(0,95;N-1):
Nếu tthực nghiệm< t(0,95;N-1) thì giá trị thực nghiệm giống với giá trị thực (X ≡ 𝜇) Nếu tthực nghiệm> t(0,95;N-1) thì giá trị thực nghiệm khác với giá trị thực (X ≠ 𝜇) nên phương pháp mắc sai số hệ thống, không chấp nhận kế quả được.
Độ lặp của một phương pháp: đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá
trị riêng lẻ xi của cùng một mẫu phân tích, được tiến hành bằng một phương pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm (người phân tích, trang thiết bị, phịng thí nghiệm) trong khoảng thời gian ngắn. và được đánh giá qua giá trị khoảng biến thiên của kết quả phân tích.
Cách tiến hành: Phân tích lặp lại 7 lần một mẫu nước tiểu, sử dụng phương pháp tốn học tính độ lệch chuẩn của 7 kết quả đo từ đó tính khoảng biến thiên của kết quả phân tích để đánh giá độ lặp lại của phép đo.
Độ thu hồi của một chất phân tích trong một thí nghiệm là lượng thu được
của chất phân tích thêm vào và chiết ra từ nền mẫu sinh học so với lượng chất thêm vào ban đầu. Độ thu hồi liên quan đến hiệu quả của quá trình chiết của phương pháp phân tích.
Giới hạn phát hiện của phương pháp là nồng độ mà tại đó giá trị xác định
được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được.
𝐿𝑂𝐷 = 3,14. 𝑆𝐷 𝑎
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của nồng độ thấp nhất đường chuẩn a là độ dốc của đường chuẩn
Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ): là điểm thấp nhất của
đường chuẩn được coi là giới hạn định lượng nếu đảm bảo các điều kiện sau:
- Tín hiệu phân tích ở điểm LOQ phải bằng ít nhất 5 lần tín hiệu của mẫu trắng.
- Tín hiệu phân tích phải đủ lớn, độc lập và lặp lại với độ chính xác 20% và độ đúng 80 – 120%
- Giới hạn định lượng của phương pháp được tính theo cơng thức [5, 6]:
𝐿𝑂𝑄 = 10. 𝑆𝐷
𝑎
Trong đó: SD là độ lẹch chuẩn của nồng độ thấp nhất đường chuẩn a là độ dốc của đường chuẩn
Đường hồi quy tuyến tính của phương pháp: Một cách đơn giản nhất mà
được dùng để biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và tín hiệu phân tích. Lựa chọn thông số và sử dụng phương trình hồi quy để biểu diễn. Các điều kiện sau được dùng để xây dựng đường chuẩn:
- Tại điểm LOQ thì sai số khơng q 20% - Các điểm khác thì sai số khơng q 15% Cách tiến hành:
* Pha dung dịch làm việc 10 mg/L của hỗn hợp 4 dạng asen As3+, As5+, DMA và MMA.
Từ dung dịch chuẩn 1 gam/L (phần 2.1.1.a) dùng Micro pipet 1mL hút chính xác 1mL vào bình định mức 100 mL và định mức tới vạch bằng nước cất, dung dịch này để bảo quản lạnh 4oC có thể dùng được trong 15 ngày.
* Chuẩn bị dãy nồng độ để xây dựng đường chuẩn.
Từ dung dịch làm việc ở trên, hút 100 µl vào bình định mức 10 ml, rồi định mức tới vạch mức bằng nước cất. dung dịch này có nồng độ 100 µg/L.
Từ dung dịch 100 µg/L hút các thể tích 20, 50, 100, 250 và 500 µl vào các ống nhựa có nắp dung tích 1,5ml. Thêm vào mỗi ống 25 µl dung dịch Ge 1 mg/L rồi định mức đến 1 ml bằng dung dịch pha động (phần 2.1.1.c). Rung lắc trên thiết bị voltex - mix khoảng 1 phút ta được các dung dịch chuẩn có nồng độ tương ứng 2μg/L, 5μg/L, 10μg/L, 25μg/L và 50μg/L. Dung dịch này pha hàng ngày trước khi phân tích.