Sau khi thu được hợp chất trung gian azide 1, chúng tôi tiếp tục thực hiện phản ứng cộng hợp đóng vòng lưỡng cực 1,3 azide-alkyne Huisgen:
Phản ứng “Click” được thực hiện với một số dẫn xuất acetylene đầu mạch sau.
Bảng 2.1: Các sản phẩm và hiệu suất của phản ứng “Click”
STT Dẫn xuất acetylene Sản phẩm Hiệu suất
1 97%
2 95%
3 98%
4 94%
5 82%
7 Không phản ứng
8 Sản phẩm không bền
Phản ứng được khảo sát trong một số hệ dung môi khác nhau như EtOH, EtOH : H2O 1 : 1, MeOH, MeOH : H2O 1 : 1, propanol, propanol : H2O 1 : 1, BuOH, BuOH : H2O 1 : 1, CH3CN. Phản ứng cho kết quả tốt nhất khi làm trong hệ dung môi t-BuOH : H2O 1 : 1. Các tỷ lệ xúc tác khác nhau cũng được khảo sát, với 20 mol-% CuSO4.5H2O và 200 mol-% natri ascobate phản ứng xảy ra hoàn toàn sau
khi khuấy qua đêm ở nhiệt độ phòng, natri ascobate được dùng dư so với lượng cần thiết để khử hoàn toàn Cu(II) thành Cu(I) để tránh Cu(I) bị oxi hóa về Cu(II) trong quá trình phản ứng. Dung dịch của CuSO4 trong nước được nhỏ từ từ vào hỗn hợp tác nhân phản ứng và muối natri ascobate đồng thời khuấy mạnh để xúc tác tạo ra phân tán đều và không kết thành cục. Các phản ứng trên xảy ra xảy ra hoàn toàn sau khi khuấy qua đêm, kiểm tra bằng TLC thấy hết hoàn toàn chất đầu, trừ trường hợp số 5 khi phản ứng sau 48 h vẫn còn một lượng nhỏ chất đầu azide. Sản phẩm thô tương đối sạch, chỉ cần chạy nhanh qua cột silica gel với dung môi ethyl acetate.
Propargyl clorua không thực hiện được phản ứng “Click” do phản ứng với muối natri ascobate. Phản ứng cũng không xảy ra thành công với acid propiolic do sản phẩm tạo ra không bền, dễ bị phân hủy.
Sản phẩm của các phản ứng “Click” được chuyển hóa tiếp bằng cách monohydroxy và dihydroxy hóa nối đôi. Quá trình monohydroxy hóa được thực hiện bằng phản ứng hydrobo hóa và oxi hóa bằng H2O2/NaOH.
TBDPSO NN N R
B2H6 THF
TBDPSO NN N R TBDPSO NN N
R
TBDPSO NN N R TBDPSO NN N
R H2O2
NaOH
HO OH
HO OH
Tác nhân B2H6 có thể thay bằng LiAlH4 + BF3.Et2O (sinh ra B2H6 trong phản ứng). Tuy phản ứng chạy tương đối tốt nhưng sản phẩm tạo ra là hỗn hợp 4 đồng phân. Các vết tương ứng với các đồng phân này trùng lên nhau khi chạy TLC. Khi chạy cột silica gel, có thể tách được một lượng nhỏ một đồng phân ra khỏi hỗn hợp (khoảng 5% so với tổng sản phẩm). Do đó chúng tôi không thực hiện tiếp hướng monohydroxy hóa, trong tương lai sẽ tìm phương pháp thay thế để có thể thu được các đồng phân riêng biệt.
Quá trình dihydroxy hóa được thực hiện với N-methylmorpholine N-oxide (NMO) với xúc tác OsO4 trong hệ dung môi THF : H2O 4 : 1.
Phản ứng tạo ra 2 đồng phân và có thể tách hoàn toàn ra khỏi nhau. Đồng phân a có độ phân cực thấp hơn đồng phân b và có Rf cao hơn. Tỷ lệ của đồng phân b trong hỗn hợp sản phẩm lớn hơn so với a, phù hợp với lý thuyết của phản ứng dihydroxy hóa. Ví dụ với sản phẩm từ phản ứng “Click” số 4 (bảng 2.1), tỷ lệ hỗn hợp ẵ là 110mg/150mg.
Tiếp đó nhóm bảo vệ TBDPS được loại bỏ bằng tetrabutyl ammonium fluoride (TBAF) trong THF. Ở giai đoạn này hiệu suất phản ứng chưa được cao.
Sản phẩm thô của phản ứng dihydroxy hóa có thể được tách nhóm bảo vệ luôn mà không tách riêng và tinh chế 2 đồng phân. Hỗn hợp sản phẩm sau khi tách nhóm bảo vệ được tách riêng ra sau. Phương pháp này cho kết quả tốt hơn so với tách riêng các đồng phân ra trước rồi loại nhóm bảo vệ sau. Do đó chúng tôi quyết định không tách riêng 2 đồng phân ở giai đoạn dihydroxy hóa mà loại nhóm bảo vệ rồi tách 2 đồng phân.
Một vấn đề sau khi tách nhóm bảo vệ là sự khó khăn khi loại bỏ muối amoni tạo ra sau phản ứng khỏi sản phẩm. Khi chiết muốn loại muối amoni, pha hữu cơ phải được rửa nhiều lần bằng dung dịch NH4Cl bão hòa hoặc NH4ClO4 bão hòa.
Một vấn đề nảy sinh là các hợp chất cyclobutane nucleoside tan tương đối tốt trong nước, do đó đối với những hợp chất có nhóm thế ở vòng 1,2,3-triazole là vòng thơm
thì khi sau khi rửa lượng chất mất đi khá nhiều còn các hợp chất có nhóm thế nhỏ như -CH2OH thì hoàn toàn tan vào pha nước. Sau khi nghiên cứu nhiều phương pháp, chúng tôi thu được kết quả rất khả quan khi chạy hỗn hợp thô qua cột sephadex. Muối amoni được tách gần hết khỏi hỗn hợp sau phản ứng (ra trước).
Phân đoạn sau được tinh chế lại bằng cột silica gel.
Hai đồng phân có nhóm thế ester được chuyển thành amide khi tác dụng với NH3/MeOH:
Bảng 2.2: Các dẫn xuất cyclobutane nucleoside thu được
STT Sản phẩm “Click” Cyclobutane nucleoside Tỷ lệ
1 45/55
2 35/65
3 45/55
4 44/56
5 40/60