2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh [6].
2.2.2.1. Phương pháp phân tích axit tổng số. Nguyên tắc:
Dựa trên phản ứng trung hịa các axit có trong mẫu bằng dung dịch kiềm NaOH 0,1 N với chất chỉ thị là phenolphtalein. Từ lượng NaOH tiêu hao tính được lượng axit tổng số có trong mẫu (khơng tính lượng axit cacbonic và SO2 tự do và liên kết có trong mẫu).
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phạm Thị Hậu
Dung dịch NaOH 0,1N, Phenolphthalein 1%. Tiến hành:
Lấy 1ml mẫu cho vào bình tam giác 250ml, sau đó cho thêm 9ml nước cất, thêm 3 giọt phenolphthalein 1%. Rồi chuẩn bằng dung dịch NaOH 0,1N tới khi dung dịch chuyển sang phớt hồng thì dừng lại. Dùng cơng thức sau để tính lượng axit tổng số:
Nồng độ axit tổng số: X(%) = .100
Trong đó: X: nồng độ axit tổng số (% axit axetic).
k: hệ số axit axetic tương ứng với 1ml NaOH 0,1N (k=0,006) V: thể tích NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ (ml).
v: thể tích dịch mẫu lấy đi chuẩn độ (ml).
2.2.2.2. Phương pháp xác định đường bằng phương pháp Ferixianua Kali
Nguyên tắc:
Dung dịch kali ferixyanua trong môi trường kiềm, dưới tác dụng của nhiệt độ cao sẽ giải phóng ra oxi nguyên tử, oxi nguyên tử sẽ oxi hóa đường thành axit. Phản ứng được thực hiện khi đun nóng với chỉ thị xanh metylen. Điểm kết thúc phản ứng xanh metylen chuyển từ màu xanh sang tím hồng rồi vàng rơm.
Phương pháp này được thực hiện nhờ phản ứng sau: 2K3Fe(CN)6 + 2KOH → 2K4Fe(CN)6 + H2O + O Tiếp theo oxi nguyên tử sẽ oxi hóa đường để tạo thành axit: CH2OH(CHOH)4CHO + 2O → HOOC(CHOH)4COOH Phương trình tổng quát của phản ứng:
2K3Fe(CN)6 + 2KOH + CH2OH(CHOH)4CHO → 2K4Fe(CN)6 + 2H2O + HOOC(CHOH)4COOH
Tiến hành:
Muốn xác định được lượng đường tổng số ta phải chuyển đường kép trong dịch quả (saccharose) thành đường đơn (đường khử). Thủy phân dịch quả ở 70-800 C
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phạm Thị Hậu
trong môi trường axit HCl trong 20 phút. Sau đó trung hịa bằng NaOH 10% rồi đem định lượng. Dùng pipet lấy 20 ml Ferixianua 1% cho vào bình tam giác 250ml + 5ml KOH 2,5N và 3 giọt xanh metylen, lắc đều và đun sơi trong 1-2 phút. Sau đó, dùng dung dịch đường để chuẩn tới khi màu xanh metylen chuyển sang vàng rơm.
Hàm lượng đường tổng D(%) = .100
Trong đó: m: Số dịch đường tiêu hao khi chuẩn độ (ml). f : hệ số pha loãng.
100: hệ số quy đổi ra 100ml.
a: Lượng đường glucose tương ứng với 20 ml Ferixianua 1% và 5ml KOH 2,5N.
Để xác định a ta làm như sau: Cân 0,5(g) glucose đã sấy đến trọng lượng không đổi hịa tan trong nước cất rồi cho vào bình định mức 100ml, ta có dung dịch glucose chuẩn chứa D = 0,5%. Lấy dung dịch này làm dung dịch chuẩn để chuẩn dung dịch 20ml Ferixyanua 1%và 5ml KOH 2,5N. Giả sử số ml đường glucose chuẩn được là a0 thì a được tính theo cơng thức là: a= a0 × 0,005.
2.2.2.3. Phương pháp phân tích hàm lượng etylic
Máy đo độ cồn: Sử dụng thiết bị đo độ cồn Salleron Dujardin Paris.
Nguyên tắc: Cồn tinh khiết có nhiệt độ sơi dưới áp suất khí quyển là 76,5oC, nhưng khi tồn tại cùng nước thì nhiệt độ sơi sẽ tăng lên và có giá trị nào đó ứng với tỉ lệ cồn/nước nhất định. Hỗn hợp cồn, nước bốc lên làm cho nhiệt độ tăng lên đỉnh điểm nào đó ứng với nồng độ cồn trong dịch lên men. Lúc này nhiệt kế chỉ nhiệt độ không đổi 2- 3 phút, đọc kết quả rồi tra bảng để xác định được % cồn trong dịch thí nghiệm.
Tiến hành: Dùng 40ml nước cất cho vào máy đo, ghi lại nhiệt độ sôi.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phạm Thị Hậu
2.2.2.3. Phương pháp phân tích hàm lượng vitamin C
Nguyên tắc: Sử dụng dung dịch Iot để oxi hóa L-ascorbic, điểm kết thúc của phản ứng nhận biết nhờ chỉ thị dung dịch tinh bột. Đây là phương pháp xác định nhanh và cho kết quả đúng.
Tiến hành: Cho 10ml dịch mẫu vào bình 250ml, cho thêm 5ml dung dịch HCl 5% thêm vài giọt tinh bột, lắc nhẹ rồi chuẩn độ bằng dung dịch Iot 0,01N tới khi xuất hiện màu xanh tím thì dừng.
Lượng vitamin C tính theo cơng thức:
Trong đó: C: Hàm lượng vitamin C (mg/l).
n: Số ml dung dịch Iot 0,01 N dùng để chuẩn độ. v: Số ml dung dịch mẫu đem phân tích.
0,88: Số mg axit ascorbic tương ứng với 1ml dung dịch Iot 0,01N.
2.2.3. Phương pháp vi sinh
Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật
Đây là phương pháp đếm tổng số vi sinh vật trực tiếp trên buồng đếm qua kính hiển vi. Đếm 4 ơ bốn góc và 1 ơ trung tâm. Lượng vi sinh vật tính theo cơng thức sau:
Trong đó:
T: Tổng số vi sinh vật (cfu/ml).
a: Là tổng số tế bào trong 5 ô vuông lớn của buồng đếm. n: Độ pha loãng.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phạm Thị Hậu
Phương pháp xác định Coliform và Ecoli
Xác định hàm lượng Coliform và Ecoli cho biết mức độ ơ nhiễm và tình trạng vệ sinh trong phân xưởng sản xuất hay nói chính xác hơn là xác định mức độ ô nhiễm của phân trong sản phẩm.
Môi trường
Mơi trường Violet Red Bile Agar (VRB) có sẵn trong chai,cân 19.75g, hịa tan trong 500 ml nước, hấp khử trùng trong 121oC trong 20 phút, làm nguội tới 450C.
Quy trình phân tích
Mẫu được pha loãng ở cấp độ 10-1, 10-2, 10-3. lấy 1ml mẫu đã pha loãng cho vào hộp lồng, bổ sung vào đĩa môi trường thạch VRB, chờ thạch đông, lật ngược đĩa, nuôi trong tủ ấm 30oC. Theo dõi và đếm khuẩn lạc trong 48- 72 giờ.
Kết quả
Đếm số lượng khuẩn lạc và tính theo cơng thức như với vi sinh vật tổng số.
Phương pháp xác định số lượng nấm men – nấm mốc
Có trong sản phẩm để đánh giá chất lượng tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm.
Nguyên tắc
Cấy trên bề mặt thạch của môi trường Yeast Glucose Chloramphenicol 100 , đã được pha loãng ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 . Mỗi nồng độ cấy lên 2 đĩa thạch. Ni ở 300C trong điều kiện hiếu khí, từ 48-72 giờ. Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa, từ đó xác định lượng nấm men, nấm mốc trong mẫu phân tích.
Thành phần môi trường:
Môi trường YGC
- Glucose : 12g
- Cao nấm men : 3g
- Thạch : 9g
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phạm Thị Hậu
- Bổ sung nước đủ 600 ml
Hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút.
Tiến hành
Môi trường và dung dịch pha loãng đem hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Pha loãng mẫu thập phân tới nồng độ 10-1,10-2, 10-3
Sau khi đổ thạch vào hộp lồng, đợi thạch đơng lại, lấy 1μl mẫu đã pha lỗng cho vào hộp lồng, dùng que trang để trang đều lên bề mặt thạch, lật sấp hộp lồng xuống, đặt vào tủ ấm khoảng 300C trong 48-72 giờ.
Kết quả
Đếm số lượng khuẩn lạc và tính theo cơng thức như với vi sinh vật tổng số.
2.2.4. Phương pháp thanh trùng
Thanh trùng là thuật ngữ chung chỉ q trình gia cơng nhiệt cho sản phẩm ở một nhiệt độ bất kỳ nào đó, nhằm mục đích tiêu diệt vsv có trong sản phẩm. Thanh trùng phải đảm bảo các yêu cầu sau:
- Phải tiêu diệt được các loại vi khuẩn có hại trong sản phẩm, đảm bảo lượng vi khuẩn cịn sống sót thấp đến mức không thể phát triển để làm hỏng sản phẩm trong thời hạn.
- Không được làm giảm giá trị sản phẩm bao gồm cả về giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan.
- Các bộ phận làm việc của máy khi tiếp xúc với sản phẩm không gây hại cho sản phẩm và ngược lại khơng bị sản phẩm ăn mịn.
Có 3 dạng thanh trùng:
- Thanh trùng ở nhiệt độ thấp: < 1000C
- Thanh trùng ở nhiệt độ cao: > 1000C
- Thanh trùng gián đoạn: gia công nhiệt 2-3 lần, khoảng cách thời gian giữa các lần thanh trùng là 20-28 giờ.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phạm Thị Hậu
2.2.5. Phương pháp đánh giá cảm quan
Sử dụng phương pháp đánh giá cho điểm theo TCVN 3217 : 1979
Phương pháp này được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan: độ trong và màu sắc, mùi, vị.
Tình trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm. Giá trị điểm tăng theo mức chất lượng
Do các chỉ tiêu có vai trị đối với chất lượng chung của sản phẩm khác nhau nên các giá trị của mỗi chỉ tiêu được nhận thêm một giá trị tương ứng gọi là hệ số trọng lượng. các chỉ tiêu có vai trị lớn hơn thì hệ số trọng lượng cao hơn, các hệ số này được xác định theo kinh nghiệm, phương pháp điều tra, kết hợp với phương pháp chuyên gia trên cơ sở thống kê
Khi đánh giá chất lượng cảm quan bằng một hội đồng thì điểm chất lượng của mỗi chỉ tiêu nào đó là điểm trung bình của các thành viên. Tổng điểm của các chỉ tiêu là điểm của chất lượng sản phẩm.
Khi đánh giá chất lượng cảm quan các sản phẩm bằng phương pháp cho điểm theo TCVN 3217:1979 điểm cảm quan được dùng hệ điểm 20 xây dựng trên 1 thang thống nhất 6 bậc 5 điểm (từ 0- 5). Trong đó điểm 0 ứng với chất lượng sản phẩm bị hỏng, còn điểm từ 1-5 ứng với mức khuyết tật giảm dần, ở điểm 5 sản phẩm coi như khơng có sai lỗi trong tính chất đang xét. Tổng hệ số trọng lượng của tất cả các chỉ tiêu được đánh giá cho 1 sản phẩm = 4. Chất lượng sản phẩm được tính là điểm trung bình của từng chỉ tiêu nhân với hệ số trọng lượng của nó.
Chỉ tiêu (điểm 0- 5) Hệ số trọng lượng
Độ trong và màu sắc 0,8
Mùi 1,2
Vị 2
Đánh giá chọn mẫu được yêu thích và đánh giá cảm quan theo mỗi tuần trong thời gian lưu mẫu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phạm Thị Hậu
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu quy trình lên men dấm táo mèo từ vi khuẩn K. saccharivorans
A2 bằng phƣơng pháp lên men chìm
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống
Tỷ lệ tiếp giống ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men axetic. Nếu tỷ lệ giống q thấp thì sẽ có ít vi khuẩn axetic dẫn đến thời gian lên men kéo dài, hiệu quả là không cao và dễ nhiễm do các vi khuẩn tạp khác phát triển mạnh hơn. Ngược lại, nếu có quá nhiều vi khuẩn thì oxi và các chất dinh dưỡng trong môi trường không đủ dẫn đến hiệu quả lên men kém. Chủng vi khuẩn K. saccharivorans A2 nuôi cấy trên môi trường nhân giống đạt lượng tế bào 4-6x108 cfu/ml sẽ được bổ sung vào mơi trường lên men. Trong thí nghiệm này, tiến hành bổ sung giống vào dịch lên men với tỷ lệ từ 7-11%. Hàm lượng axit tạo ra được phân tích theo thời gian lên men, kết quả thí nghiệm được thể hiện tại hình 3.1.
Khi tiếp giống ở 9%, sau 120 giờ đạt được hiệu suất lên men tốt nhất với nồng độ axit đạt 4,32% sau đó giảm dần ở các ngày tiếp theo. Điều này có thể được giải thích như sau: quá trình lên men axetic kết thúc ở ngày thứ 5, sau đó do q trình oxi hóa hồn tồn bắt đầu xảy ra khi cồn trong dịch hết, axit axetic bị oxi hóa tạo nước và CO2 nên nồng độ đã giảm xuống. Như vậy, tỷ lệ tiếp giống ban đầu là 9% sẽ được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.1: Ảnh hƣởng của tỷ lệ tiếp giống tới khả năng sinh axit của chủng K.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phạm Thị Hậu
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn ban đầu
Trong điều kiện lên men dấm chìm nguồn cơ chất chủ yếu cho quá trình lên men là cồn. Nếu nồng độ lên men quá cao, vi khuẩn axetic vẫn có khả năng thích ứng dần để phát triển nhưng như vậy sẽ kéo dài thời gian lên men. Tuy nhiên, nếu trong mơi trường khơng cịn cồn thì chủng giống vi khuẩn axetic sẽ chết dần. Vì vậy lượng cồn bao nhiêu thì đủ để lên men mà không gây ức chế ngược lại cho chủng vi khuẩn là điều cần nghiên cứu.
Chủng vi khuẩn K. saccharivorans A2 nuôi cấy trên môi trường nhân giống đạt lượng tế bào 4-6x108 cfu/ml sẽ được bổ sung vào môi trường lên men với tỉ lệ tiếp giống là 9%. Quá trình lên men dấm bởi chủng K. saccharivorans A2 được thử
nghiệm với nồng độ cồn ban đầu từ 4%-8%. Sau 7 ngày lên men, hàm lượng axit tạo ra được phân tích theo thời gian lên men và được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2: Ảnh hƣởng của nồng độ cồn ban đầu tới khả năng sinh axit của chủng K. saccharivorans A2 (%)
Kết quả cho thấy hàm lượng ethanol ảnh hưởng mạnh tới quá trình sinh axit của chủng vi khuẩn A2, khi nồng độ ethanol trong môi trường là 5%, hàm lượng axit tổng thu được đạt 3,45% sau 120 giờ nuôi cấy; với hàm lượng ethanol 6% lượng axit tổng đạt 4,17% sau 120 giờ nuôi cấy. Khi bổ sung ethanol với nồng độ cao hơn 6% lượng axit tổng giảm dần, tại nồng độ etanol đạt 8% lượng axit tổng chỉ đạt
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phạm Thị Hậu
lên men cao nhất và thời gian lên men nhanh nhất. Nồng độ cồn ban đầu 6% sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung axid axetic
Môi trường axit là môi trường thuận lợi cho vi khuẩn axetic phát triển, đồng thời ức chế vi khuẩn có hại. Vì vậy, trong lên men sản xuất axit axetic, người ta thường bổ sung thêm axit axetic. Chủng vi khuẩn K. saccharivorans A2 nuôi cấy trên môi trường nhân giống đạt lượng tế bào 4-6x108 cfu/ml sẽ được bổ sung vào môi trường lên men với tỷ lệ tiếp giống ban đầu 9%, nồng độ cồn ban đầu 6%. Trong thí nghiệm này chúng tơi đã tiến hành nghiên cứu bổ sung lượng axit axetic trong dải từ 0,3-0,7%.
Kết quả cho thấy hàm lượng axit axetic ảnh hưởng tới quá trình sinh axid của chủng vi khuẩn A2, khi nồng độ axit axetic trong môi trường là 0,4%, hàm lượng axit tổng thu được đạt 3,45% sau 120 giờ nuôi cấy; với hàm lượng axit axetic 0,6% lượng axid tổng đạt 4,37% sau 120 giờ nuôi cấy. Khi bổ sung axit axetic với nồng độ cao hơn 0,6% lượng axit tổng giảm dần, tại nồng độ axit axetic đạt 0,7% lượng axix tổng chỉ đạt 3,87% sau 120 giờ lên men. Như vậy khi ở nồng độ axit axetic là 0,6% thì có hiệu quả lên men cao nhất và thời gian lên men nhanh nhất. Nồng độ axit axetic ban đầu 0,6% sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.3: Ảnh hƣởng của tỷ lệ bổ sung axit aetic tới khả năng sinh axit của chủng K.saccharivorans A2 (%)
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phạm Thị Hậu
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường saccharose bổ sung
Komagataeibacter có khả năng sinh tổng hợp axit axetic từ D-glucose, D-
galactose, D-xylose, L-arabinose hoặc ethanol nhưng khơng chuyển hóa được D- fructose, L-sorbose, D-mannitol, D-sorbitol, maltose và lactose thành axid axetic [22]. Đối với chủng vi khuẩn K. saccharivorans A2, đường saccharose là nguồn
cung cấp dinh dưỡng cho sự sinh trưởng, phát triển và ảnh hưởng đến quá trình lên men dấm. Chủng vi khuẩn K. saccharivorans A2 nuôi cấy trên môi trường nhân giống đạt lượng tế bào 4-6x108 cfu/ml sẽ được bổ sung vào môi trường lên men với nồng độ tiếp giống ban đầu 9%, hàm lượng cồn đầu 6%, hàm lượng axit axetic bổ sung 0,6%. Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose bổ sung trong khoảng từ 7 g/l đến 11 g/l, kết quả phân tích thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4: Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng saccharose bổ sung tới khả năng sinh axit của chủng K. saccharivorans A2 (%)