3.2. Kết quả phân tích đặc điểm nucleoprotein vi rút dại
3.2.1. Đặc điểm chung về phân tử nucleoprotein của vi rút dại
Protein N của vi rút dại (chủng PV) gồm có 450 axit amin (một số vi rút có 451 axit amin), một trong số chúng được phosphoryl hóa, và có trọng lượng phân tử khoảng 57 kDa. Trình tự axit amin của protein N là bảo tồn nhất trong số các protein của vi rút dại ở cả 7 genotype. Do đặc tính tự nhiên được bảo tồn của gien N, nên có một mức độ đa dạng di truyền tương đối cao trong các đoạn ngắn của gien N giữa các genotype (Conzelmann và cộng sự., 1990; Bourhy và cộng sự., 1993, 1999; Kissi và cộng sự., 1995; Kuzmin và cộng sự., 2005). Một nguyên nhân quan trọng về mức độ bảo tồn cao của trình tự axit amin, đặc biệt ở những vùng đặc hiệu của gien N, có thể là do chúng giữ các chức năng quan trọng. Mặt khác, những khác biệt về axit amin có thể là do các epitope chuyên biệt genotype trên gien N có khả năng phân loại các vi rút thành các genotype khác nhau dựa trên cơ sở các kiểu hoạt tính của chúng (đặc tính kháng nguyên) nhờ một bộ mẫu chuẩn các kháng thể đơn dòng kháng N (Mabs) (Flamand và cộng sự., 1980a; Dietzschold và cộng sự., 1987a; Smith, 1989). Sự đa dạng về chất lượng trong gien N cũng được khai thác ở
mức độ nucleotide bằng kỹ thuật PCR (Sacramento và cộng sự, 1991; Bourhy và cộng sự, 1993; Kuzmin và cộng sự, 2003). Vị trí gắn trên gien N để giúp chúng có khả năng tương tác với ARN của vi rút được đặt trên một vùng gien N từ axit amin 298 đến 352 (Kouznetzoff và cộng sự, I998). Sau khi gắn vào ARN của vi rút, gien N thực hiện việc thay đổi cấu tạo thì cần một số epitop, mà một trong số chúng cho phép axit amin serine (S) tồn dư ở vị trí 389 trên gien N được phosphoryl hóa (Dietzschold và cộng sự, 1987a; Anzai và cộng sự., 1997; Kawai và cộng sự., 1999; Toriumi và Kawai, 2004). Trong quá trình sao chép ARN ở tế bào nhiễm bệnh, có ý kiến cho rằng việc tạo vỏ capsid của ARN vi rút mới là do gien N tạo ra một hình dáng giống vỏ capsid làm thay đổi gien N từ đó tạo ra tồn dư S389 cần thiết cho q trình phosphoryl hóa (Kawai và cộng sự., 1999). Sau đó q trình phosphoryl hóa gien N củng cố mối tương tác giữa gien N và P trong phức hợp RNP của vi rút dại (Toriumi và Kawai, 2004). Từ đó suy luận rằng quá trình phosphoryl hóa của gien N sau khi tạo vỏ capsid ARN là rất quan trọng trong việc điều chỉnh việc sao chép và dịch mã ARN của vi rút (Yang và cộng sự., 1999; Wu và cộng sự., 2002; Liu và cộng sự., 2004).
Cấu trúc vịng ưa thích được tạo ra cùng gien N tái tổ hợp đã được phosphoryl hóa và ARN vi rút với mơ hình RNP của vi rút, có cấu trúc xoắn ốc tương tự như lõi RNP của vi rút (Iseni và cộng sự., 1998; Schoehn và cộng sự., 2001; Albertini và cộng sự., 2006). Hình dáng “hai thùy” của các cấu trúc vòng cho thấy các phân tử gien N (các promoter) liên kết chặt chẽ như thế nào trong cấu trúc RNP, gắn với 9 nucleotide trên ARN của vi rút. Việc gắn chặt này giúp bảo vệ ARN của vi rút khỏi hoạt tính ribonuclease (Iseni và CS., 1998). Điều này rất cần thiết để phần nguyên sinh của gien N phân tách chúng ra khỏi ARN giúp ARN trở thành khuôn cho quá trình polymerase. Một hoặc một số phần nguyên sinh của gien N có thể phân tách tại chỗ để cung cấp đủ không gian cho việc polymerase ARN để gắn.
Gien N là gien được phân tích nhiều thứ hai trong số các protein của vi rút dại (sau gien G) do cấu trúc và chức năng kháng nguyên và tính sinh miễn dịch của chúng. Gien N cũng là một mục tiêu quan trọng đối với các tế bào T trợ giúp (Th)
có thể phản ứng chéo giữa các vi rút dại và vi rút liên quan đến dại (Celis và CS., 1988a, 1988b; Ertl và CS., 1989). Một vài epitope của tế bào Th ở gien N của vi rút dại được xác định và lập bản đồ bằng cách dùng một chuỗi các peptide tổng hợp trùng khớp tương ứng với độ dài của các trình tự gien N là khoảng 15 axit amin (Ertl và CS., 1989). Các peptide sinh kháng nguyên (tạo ra một epitope đặc hiệu cho mỗi tập hợp con của các tế bào Th) có khả năng kích thích các tế bào Th biệt hóa vi rút dại in vitro đã được lựa chọn và sau đó được thử nghiệm kích thích các tế bào Th biệt hóa vi rút dại in vivo (Ertl và CS., 1989, 1991 ). Chính mỗi peptide đó, đã tạo ra 31D, tương ứng với vị trí tồn dư gien N từ 404-418, được phát hiện ra là một epitope có ưu thế miễn dịch có khả năng kích thích sản xuất ra các tế bào Th biệt hóa vi rút dại, ít nhất là in vitro. Các peptide tương tự cũng tạo ra một tế bào Th quan trọng đáp ứng in vivo và một đáp ứng kháng thể trung hòa vi rút (VNA - virus-neutralizing antibody) tăng tốc sau mỗi lần miễn dịch nhắc lại với vắc xin vi rút dại đã bất hoạt in vivo (Ertl và CS ., 1989). Tuy nhiên, chỉ có đáp ứng tế bào Th sinh peptide hoặc sự tăng cường nồng độ VNA tạo ra bởi epitope của peptide này trong một liều vắc xin nhắc lại, dẫn đến ưu thế miễn dịch, đủ để bảo vệ ngăn ngừa một liều vi rút thử thách ở chuột.
Cuối cùng, từ các đặc tính khác và các đáp ứng miễn dịch của vi rút dại đã gợi ra cho chúng ta suy luận rằng các chức năng gien N của vi rút dại là một siêu kháng nguyên ngoại sinh (Lafon và CS., 1992). Đây có lẽ là siêu kháng nguyên vi rút duy nhất được xác định ở người (Lafon, 1997). Các đặc tính và đáp ứng khơng chỉ được tìm thấy ở người mà cịn tìm thấy ở chuột có được chủ yếu ở gien N vi rút dại là do vai trò của siêu kháng nguyên bao gồm:
1. Kích thích hoạt động của các tế bào lymphocyte máu ngoại vi trong các loại vắc xin trên người (Herzog và CS., 1992)
2. Có khả năng tạo ra một đáp ứng VNA nhanh hơn và mạnh hơn khi tiêm các vắc xin dại đã bất hoạt (Dietzschold và CS., 1987b; Fu và CS, 1991).
3. Kích thích các q trình hoạt hóa tế bào T sớm đồng thời mở rộng và huy động các tế bào CD4+
Vβ8 để kích hoạt và hỗ trợ tạo ra VNA (Lafon và CS., 1992; Martinez-Arends và CS., 1995).
4. Có khả năng liên kết với các kháng nguyên hịa hợp mơ - HLA cấp II biểu hiện trên bề mặt của các tế bào (Lafon và CS., 1992).
3.2.2. Mức độ tương đồng nucleotide và axit amin của các chủng vi rút dại
Mức độ đồng nhất nucleotide khi phân tích trình tự nucleotide của gien N gồm 500 nucleotide – Nu của các chủng vi rút dại lưu hành tại miền Bắc, Việt Nam, 2006 – 2012 với các chủng vi rút dại lưu hành tại miền Nam 2006 – 2009 và một số nước lân cận cho thấy có độ đồng nhất cao và cao nhất với nhóm chủng phân lập ở miền Nam, Việt Nam (87,7% - 99,2%) , tiếp đó tới nhóm chủng phân lập ở Philippines (87,5% - 100%), Trung Quốc – Guangxi (82,2% - 92,8%) và thấp nhất là các chủng phân lập tại Tây Á (81,8% – 88,6%). Độ đồng nhất nucleotide ở đoạn gien N phân tích của các chủng vi rút phân lập ở Việt Nam so với các chủng vi rút sản xuất vắc xin dại dại Fuenzalida (chủng PV); Verorab (chủng PM) và chủng Vnukovo – 32 là 84,5% - 96,9%.
Mức độ tương đồng axit amin khi phân tích vùng bảo tồn 150 axit amin (vị trí 1 đến 150) trong số 450 axit amin của nucleoprotein (protein N) của các chủng vi rút lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2012 với các chủng vi rút dại lưu hành ở Miền Nam 2006 – 2009 và một số nước lân cận cho thấy có độ tương đồng cao và cao nhất đối với nhóm chủng phân lập ở miền Nam, Việt Nam (96,6% - 100%), tiếp đó tới nhóm chủng phân lập ở miền Nam Trung Quốc – Quảng Đông, Guang xi (95,5 – 100%), Philippine (95,5 – 100%) và thấp nhất là các chủng phân lập tại Tây Á (92,8 – 98,9%). Độ tương đồng axit amin ở đoạn gien N phân tích của các chủng vi rút phân lập ở Việt Nam so với các chủng vi rút sản xuất vắc xin dại Fuenzalida (chủng PV); Verorab (chủng PM) và chủng Vnukovo – 32 là 92,2 – 97,1%.
Mức độ đồng nhất (identity) về nucleotide và mức độ tương đồng (homology) về axit amin giữa các chủng vi rút dại phân lập được trên người và
chó thu thập tại miền Bắc Việt Nam được trình bày ở bảng 3.5. Qua so sánh 450 nucleotide (tương ứng với 150 axit amin), các chủng vi rút dại thu thập tại miền Bắc có tỷ lệ tương đồng rất cao về axit amin (96,6% - 100%) và đồng nhất về nucleotide (88,6 – 99,2) đối với nhóm chủng phân lập ở miền Nam, Việt Nam. Với nhóm chủng phân lập ở miền Nam, Trung Quốc – Quảng Đông, Guang xi mức độ này thấp hơn (95,5 – 100% về axit amin và 82,2 – 92,8 về nucleotide) và thấp nhất là các chủng phân lập tại Tây Á (92,8 – 98,9% về axit amin và 81,8 – 88,6 về nucleotide). Độ tương đồng axit amin ở đoạn gien N phân tích của các chủng vi rút phân lập ở miền Bắc Việt Nam so với các chủng vi rút sản xuất vắc xin dại Fuenzalida (chủng PV); Verorab (chủng PM) và chủng Vnukovo – 32 tương đối cao là 92,2 – 97,1%.
Kết quả trên cho thấy khơng có sự sai khác nhiều về nucleotide và axit amin giữa các chủng vi rút dại tại miền Bắc với các chủng vi rút dại sản xuất vắc xin dại đang được sử dụng tại Việt Nam, từ đó có thể khẳng định các vắc xin này có thể sử dụng để dự phòng bệnh dại tại Việt Nam.
Bảng 3.4. Sự tương đồng về axit amin và nucleotide của các chủng vi rút dại phân lập tại Việt Nam so với các chủng vi rút dại ở các nước Châu Á và các chủng dùng làm vắc xin.
Tên nƣớc Mã số ở ngân hàng gien Tên chủng Nucleotide (%) Axit amin (%)
Philippines AB070759 87,5 – 100 96,6 – 100 AB070817 87,5 – 98,5 95,5 – 98,9 Sri-Lanka U22917 81,8 – 84,8 92,0 – 93,2 AB041964 SRL1032 83,7 – 88,6 96,6 – 98,9 AB041965 SRL1036 83,7 – 88,6 96,6 – 98,9 AB041966 SRL1060 83,7 – 88,3 96,6 – 98,9 Nepal 94260 84,5 – 87,1 96,6 – 97,7
Malaysia U22916 867MAL 86,0 – 94,3 94,3 – 96,6
Trung Quốc EF555112 GDZQDN45 86,7 – 89,0 95,5 – 98,9 EF555102 CQQJDN06 86,0 – 90,9 96,6 – 100 EF555100 CQQJDN04 84,5 – 89,5 95,8 – 98,9 EF555098 CQQJDN02 82,2 – 85,2 92,0 – 93,2 EF555099 CQQJDN03 82,2 – 85,2 92,0 – 93,2
Tên nƣớc Mã số ở ngân hàng gien Tên chủng Nucleotide (%) Axit amin (%)
EF555106 SDJNCN01 86,7 – 92,8 96,6 – 97,7
Miền Nam Việt Nam
AB116579 88,6 – 98,9 96,6 – 98,9 AB116580 89,0 – 99,2 97,7 – 100 AB116581 87,5 – 90,2 97,7 – 100 Chủng sản xuất vắc xin PM 85,6 – 91,3 95,7 – 96,8 PV 84,5 – 89,9 92,2 – 96,9 Vnukovo 84,5 – 89,9 94,2 – 97,1
3.2.3. Sự xuất hiện các đa hình đơn nucleotide (SNP – Single nucleotide polymorphism) đặc trưng ở các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2012.
Bảng 3.5. kết quả so sánh và sắp xếp trình tự nucleotide của 31 chủng vi rút dại phân lập tại miền Bắc, Việt Nam với 8 chủng vi rút lưu hành tại Miền Nam, Tây Nguyên; các chủng vi rút vắc xin; chủng Quốc tế và các chủng vi rút lưu hành ở một số nước châu Á bằng phần mềm MEGA 4, sử dụng trình tự nucleotide của chủng PV được công bố bởi Tordo và cộng sự làm cơ sở so sánh. Kết quả cho thấy xuất hiện 2 vị trí đa hình đơn nucleotide (SNP) là T124 (Thymine 124) và C330 (Cytosine 330) trong đó:
a) Tại vị trí T124 xuất hiện ở 8 chủng vi rút thuộc nhóm 1A, các chủng vi rút này tập trung thành một cluster trên cây di truyền 3.4 và lưu hành tại các tỉnh Lạng Sơn, Sơn La, Lào Cai, Phú Thọ từ 2008 – 2012 và 01 chủng phân lập được tại tỉnh Quảng Đông – Trung Quốc năm 2009.
b) Tại vị trí C330 xuất hiện ở 18 chủng vi rút tập trung thành một cluster, thuộc nhóm 1A. Các chủng vi rút này lưu hành tại các tỉnh Hà Nội, Phú Thọ, Hịa Bình, Tun Quang, Thái Bình từ 2007 – 2012.
c) Riêng tỉnh Phú Thọ đồng thời lưu hành các chủng vi rút dại có SNP tại vị trí T124 và các chủng vi rút dại có SNP tại vị trí C330.
Chính từ sự thay đổi ở 2 vị trí nucleotide có tính quyết định này đã dẫn tới làm thay đổi 2 axit amin được nêu ra trong bảng 3.6.
Kết quả bảng 3.5 cho thấy có sự xuất hiện 2 vị trí thay đổi nucleotide T124 và C330 tương ứng với axít amin S42 và D110 ở các chủng vi rút dại lưu hành tại miền Bắc Việt Nam và một số chủng phân lập ở Trung Quốc. Tác giả Qi Liu và CS (năm 2007) cũng tìm thấy sự xuất hiện các SNP và axit amin tương tự ở vị trí này trên các chủng vi rút dại lưu hành tại tỉnh Guangxi, Trung Quốc (2007). Như vậy rõ ràng các chủng vi rút dại phân lập tại miền Bắc và các chủng vi rút dại tại Trung Quốc có mối liên hệ tiến hóa rất gần gũi với nhau, điều đó có thể xác định rằng tác nhân gây bệnh dại tại một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam rất có thể là do vi rút dại từ
Trung Quốc tràn sang hoặc ngược lại hoặc chúng cùng xuất phát từ một nguồn nào đó. Đồng thời, đây cũng là bằng chứng để theo dõi vi rút học xác định vi rút dại từ bên ngoài xâm nhập vào Việt Nam và lan truyền sang các vùng khác nhau trong lãnh thổ Việt Nam, bằng chứng này cũng sẽ giúp cho chúng ta đánh giá hiệu quả của các phương pháp phòng chống trong những năm tới.
Hình 3.8. Sự lƣu hành các chủng vi rút dại xuất hiện các SNP ở vị trí T124 và C330 tại miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2012.
Hình 3.8. bản đồ sự lưu hành các chủng vi rút dại xuất hiện các SNP tại miền Bắc Việt Nam, cho thấy có SNP ở vị trí T124 (Thymine 124) xuất hiện ở các chủng phân lập tại các tỉnh Phú Thọ, Lạng Sơn, Sơn La, Yên Bái và Lào Cai. Và SNP tại vị trí C330 (Cytosine 330) xuất hiện ở các chủng phân lập tại các tỉnh Tuyên Quang, Hà Nội, Phú Thọ, Hịa Bình và Thái Bình. Riêng tỉnh Phú Thọ thấy đồng thời lưu hành các chủng có SNP tại vị trí C330 và các chủng có SNP tại vị trí T124.
3.2.4. Trình tự acid amin đặc trưng xuất hiện ở các chủng vi rút dại lưu hành ở Miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2012
Bảng 3.6. kết quả so sánh và sắp xếp trình tự axit amin của 31 chủng vi rút dại phân lập tại miền Bắc, Việt Nam với 8 chủng vi rút lưu hành tại Miền Nam, Tây Nguyên; các chủng vi rút vắc xin; chủng Quốc tế và các chủng vi rút lưu hành ở một số nước châu Á bằng phần mềm MEGA 4, sử dụng trình tự axit amin của chủng PV được công bố bởi Tordo và cộng sự làm cơ sở so sánh. Kết quả cho thấy xuất hiện 2 vị trí axit amin đặc trưng ở một số chủng vi rút hoang dại lưu hành tại miền Bắc Việt Nam là S42 (Serine 42) và D110 (Aspartic 110). Sự xuất hiện các axit amin đặc trưng này là do sự xuất hiện SNP trong bộ ba mã hóa axit amin tại T124 và C330 (bảng 3.5). Cụ thể thời gian và địa điểm phân lập các chủng như sau:
a) Tại vị trí axit amin S42:
Năm 2008, 1 chủng phân lập trên người tại tỉnh Lạng Sơn.
Năm 2011, 2 chủng phân lập ở chó tại tỉnh Sơn La và Lào Cai.
Năm 2012, 1 chủng phân lập trên người tại tỉnh Phú Thọ và 4 chủng phân lập trên chó tại tỉnh Yên Bái.
b) Tại vị trí axit amin D110:
Năm 2007, 5 chủng phân lập trên người tại Hà Nội, Phú Thọ.
Năm 2008, 6 chủng phân lập trên người tại Hà Nội, Hịa Bình, Phú Thọ, Tun Quang.
Năm 2009, 1 chủng phân lập trên người tại Hà Nội.
Năm 2010, 5 chủng phân lập trên người tại Hà Nội, Phú Thọ và Thái Bình.
Năm 2012, 1 chủng phân lập trên người tại Phú Thọ.
Riêng tỉnh Phú Thọ thấy đồng thời lưu hành chủng vi rút có axit amin đặc trưng tại vị