Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Tỏch dũng hộp gen M1 vào vector pCR2.1
Trƣớc khi đƣa vào vector biểu hiện baculovirus, sản phẩm PCR của gen M1
đƣợc tinh sạch qua kit tinh sạch PCR (Fermentas, Đức), sau đú đƣợc đƣa vào vector tỏch dũng pCR2.1 (Invitrogen, Mỹ). Việc tỏch dũng đƣợc thực hiện bằng cỏch gắn trực
1 2
2
tiếp sản phẩm PCR vào vector tỏch dũng pCR2.1 sau đú biến nạp vào E.coli rồi tỏch
chiết lại plasmid để chọn lọc vector tỏi tổ hợp. Cỏc vector chứa gen M1 đƣợc kớ hiệu là pCRM1.
3.3.1. Gắn sản phẩm PCR chứa hộp gen M1 vào vector pCR2.1
Phản ứng gắn đƣợc thực hiện với mục đớch tạo vector tỏi tổ hợp mang đoạn gen cần tỏch dũng. Quỏ trỡnh gắn dựa vào đặc tớnh xỳc tỏc hỡnh thành liờn kết nối hai đoạn DNA của enzym T4 DNA ligase. Chỳng tụi sử dụng enzym T4 DNA ligase cú nguồn gốc từ phage T4 xõm nhiễm E.coli, enzym này cú khả năng nối hai trỡnh tự DNA cả đầu so le và đầu bằng. Mẫu đƣợc ủ ở 14°C trong 16 giờ. Đõy là nhiệt độ thớch hợp nhất cho enzym T4 DNA ligase hoạt động. Vector tỏi tổ hợp mong muốn sẽ là vector gắn với sản phẩm PCR mang gen mó húa protein M1.
3.3.2. Biến nạp vector tỏi tổ hợp vào tế bào E.coli chủng DH5α
Plasmid tỏi tổ hợp thu đƣợc từ phản ứng gắn trờn đƣợc biến nạp vào tế bào
E.coli chủng DH5α bằng phƣơng phỏp sốc nhiệt. Nhờ bộ mỏy tổng hợp của vi khuẩn,
plasmid sẽ đƣợc tạo ra cỏc bản sao với số lƣợng lớn. Sau khi biến nạp, thể biến nạp đƣợc cấy trải trờn mụi trƣờng LB đặc cú bổ sung Amp (100àg/ml), IPTG (1mM) và X- gal (100 àg/ml) (5- brome – 4 chloro -3 indonyl ò galactoside). Sau đú nuụi trong tủ ấm 370C qua đờm. Kết quả thu đƣợc hai loại khuẩn lạc cú màu xanh, trắng (hỡnh 3.2). Cỏc khuẩn lạc màu xanh đƣợc dự đoỏn là cỏc khuẩn lạc mang vector pCR2.1 khụng chứa hộp gen M1, vector tự đúng vũng. Điều này là do gen Lac-Z hoạt động bỡnh thƣờng, tổng hợp đƣợc enzym ò- galactosidase, enzym này sẽ thủy phõn cơ chất X- gal thành sản phẩm cú khả năng kết hợp với oxi tạo chất cú màu xanh da trời là 5,5 dibrome -4,4 dichloro indigo. Ngƣợc lại những khuẩn lạc màu trắng đƣợc dự đoỏn chứa vector tỏi tổ hợp mang hộp gen mó húa protein M1. Việc gen M1 chốn vào giữa Lac – promotor và gen cấu trỳc Lac –Z dẫn đến gen Lac – Z bị dịch chuyển khung đọc mở (ORF) do đú khụng tổng hợp đƣợc enzym ò- galactosidase.
37
Hỡnh 3.2: Kết quả biến nạp DNA plasmid vào DH5α
3.3.3. Tỏch chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli
Để chọn đƣợc dũng plasmid tỏi tổ hợp pCRM1 mang hộp gen M1, chỳng tụi nhặt một số khuẩn lạc trắng và một khuẩn lạc xanh, nuụi cấy trong mụi trƣờng LB cú bổ sung khỏng sinh Amp (100àg/ml), lắc tốc độ 200v/p ở 37°C qua đờm. Tỏch chiết plasmid từ cỏc tế bào nuụi cấy, sau đú tiến hành chạy điện di trờn gel agarose 1% kốm theo đối chứng là plasmid gốc. Kết quả đƣợc thể hiện ở hỡnh 3.3.
Hỡnh 3.3: Chọn lọc cỏc dũng plasmid pCR2.1 tỏi tổ hợp mang hộp gen M1 bằng điện di trờn gel agarose 1%.
Đƣờng chạy từ 1-4: DNA plasmid tỏch từ khuẩn lạc trắng Đƣờng chạy 5: DNA plasmid tỏch từ khuẩn lạc xanh
Theo lớ thuyết điện di thỡ phõn tử DNA nào cú kớch thƣớc càng lớn thỡ di chuyển càng chậm, tức là trờn ảnh quan sỏt đƣợc nú sẽ tạo đƣợc vạch sỏng cao hơn so với cỏc phõn tử DNA cú kớch thƣớc nhỏ hơn. Trong vector tỏi tổ hợp ngoài phần gốc là vector pCR2.1 cũn gắn thờm sản phẩm PCR nờn sẽ di chuyển chậm hơn vector gốc pCR2.1 là plasmid tỏch từ khuẩn lạc xanh.
Quan sỏt kết quả điện di trờn cho thấy cú sự chờnh lệch về kớch thƣớc giữa plasmid tỏch từ khuẩn lạc xanh và plasmid tỏch từ khuẩn lạc trắng. Cỏc plasmid từ 1 đến 4 đƣợc tỏch từ khuẩn lạc trắng đều cú đƣờng chạy cao hơn plasmid số 5 đƣợc tỏch từ khuẩn lạc xanh. Điều đú chứng tỏ cỏc dũng plasmid từ 1-4 cú khả năng mang hộp gen M1.
Để khẳng định cỏc plasmid đƣợc tỏch từ khuẩn lạc trắng cú mang hộp gen hay khụng chỳng tụi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn.
3.3.4. Chọn lọc vector tỏi tổ hợp bằng cắt với enzym giới hạn
Để khẳng định chắc chắn cỏc dũng DNA plasmid cú mang hộp gen M1, chỳng tụi tiến hành cắt kiểm tra cỏc DNA plasmid này bằng enzym giới hạn BamH I và Hind III. Hai enzym này đƣợc gắn tƣơng ứng ở đầu 5’ và 3’ của gen. Theo lý thuyết, cỏc dũng plasmid gắn sản phẩm PCR sau khi đƣợc cắt bằng hai enzym giới hạn BamH I và
Hind III sẽ văng ra một đoạn cú kớch thƣớc tƣơng đƣơng với kớch thƣớc của sản phẩm
PCR. Ba dũng plasmidcú kớch thƣớc lớn hơn plasmid gốc đƣợc chọn để phõn tớch tiếp bằng phản ứng cắt với hai enzym giới hạn BamH I và Hind III . Sau đú kiểm tra điện di trờn gel agarose 1% (hỡnh 3.4).
39
Hỡnh 3.4: Kiểm tra cỏc dũng vector tỏi tổ hợp mang hộp gen M1 bằng điện di trờn gel agarose 1%.
1: Sản phẩm PCR gen M1 (dựng làm đối chứng)
2 – 4 : 3 dũng DNA plasmid tỏi tổ hợp đƣợc xử lý bằng enzym giới hạn
BamH I và Hind III.
M : Marker DNA
1 2 3 4 M
780bp
3000bp
Kết quả phõn tớch sản phẩm cắt DNA plasmid tỏi tổ hợp cho thấy ở đƣờng chạy số 3, 4 xuất hiện băng cú kớch thƣớc khoảng 780bp tƣơng đƣơng với kớch thƣớc của gen M1. Đƣờng chạy số 2 chỉ xuất hiện băng DNA plasmid mở vũng, cú khả năng
plasmid này khụng mang sản phẩm PCR hoặc do trỡnh tự nhận biết của enzym giới hạn
BamH I và Hind III ở sản phẩm PCR đó bị biến đổi khiến cho enzym khụng thể nhận
biết để cắt. Từ kết quả trờn, chỳng tụi cú thể kết luận sơ bộ đó thu đƣợc 2 dũng plasmid tỏi tổ hợp mang hộp gen M1. Tuy nhiờn để khẳng định cần cú cỏc phõn tớch tiếp theo.