3.1. Kết quả sàng lọc aptamer liên kết E. coli O157:H7
Quy trình SELEX sàng lọc aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7 điển
hình gồm ba quá trình:
- Chọn lọc những trình tự oligonucleotit (aptamer) gắn với E. coli O157:H7
từ thƣ viện.
- Loại bỏ những aptamer không gắn hoặc gắn không đặc hiệu với E. coli
O157:H7.
- Thu nhận và khuếch đại những aptamer gắn đặc hiệu với vi khuẩn E. coli
O157:H7.
Trong đó, để bắt đầu một chu kỳ sàng lọc, chuẩn bị thƣ viện oligonucleotit là một bƣớc rất quan trọng.
3.1.1. Chuẩn bị thư viện
Quy trình SELEX sàng lọc aptamer bắt đầu từ một thƣ viện oligonucleotit DNA ngẫu nhiên có số phân tử lớn, đa dạng 1015 phân tử. Từ thƣ viện ssDNA có trình tự 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – N36 – ATA CGG GAG CCA ACA CCA AGG CTTC – 3’ tiến hành làm giàu để chuẩn bị nguyên liệu khởi đầu cho quá trình sàng lọc. Tồn bộ quy trình đƣợc trình bày ở mục 2.2. Kết quả của quá trình này đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1: Kết quả PCR làm giàu thƣ viện
Giếng M: thang DNA 100 bp (Fermentas).
Sản phẩm PCR 100 bp
Hình ảnh điện di cho thấy trên đƣờng chạy xuất hiện một băng sáng đậm có kích thƣớc khoảng 70bp. Kết quả này đúng với tính tốn lý thuyết về độ dài của aptamer, chứng tỏ thƣ viện oligonucleotit đã đƣợc nhân lên thành công với số lƣợng lớn, đủ đáp ứng cho quá trình sàng lọc.
Sau PCR, sản phẩm thu đƣợc là một hỗn hợp các trình tự oligonucleotit sợi đơi có độ đa dạng cao và số lƣợng phân tử lớn. Tuy nhiên, chỉ có ssDNA mới có thể cuộn gấp hình thành cấu trúc thứ cấp phức tạp để liên kết phân tử đích. Do đó, q trình xử lý cắt sợi đôi thành sợi đơn cần thiết đƣợc thực hiện.
Một số phƣơng pháp hiện đang đƣợc sử dụng để tạo sợi đơn sau PCR nhƣ sau:
- Một lƣợng dƣ biotin đƣợc đƣa vào một trong hai mồi sử dụng trong PCR, sau đó các sợi DNA sẽ đƣợc tách ra dƣới điều kiện biến tính trong một cột với streptavidin [75].
- Sử dụng phản ứng khuếch đại PCR bất đối xứng, trong đó sự sao chép bắt đầu bởi một mồi PCR rất kém hiệu quả, dẫn đến sự tích lũy của ssDNA đƣợc tổng hợp từ những mồi khác [22].
- Một vùng đệm hexaethyleneglycol (HEGL) và một phần mởrộng của một số nucleotit adenine (polyA) đƣợc thêm vào đầu 5’ của mồi ngƣợc. Vùng đệm HEGL hoạt động nhƣ một dấu hiệu kết thúc cho Taq Polymerase. Sự kéo dài chuỗi của sợi dƣơng dừng lại, trong khi sợi âm đƣợc tiếp tục. Sau đó, sử dụng điện di để tách hai sợi đơn.
- Một nhóm photphat đƣợc gắn vào đầu 5’ của một mồi, sau đó sợi đơi DNA thu đƣợc từ PCR sẽ đƣợc xử lý bằng enzyme lamda exonuclease. Enzyme này sẽ
cắt hồn tồn những sợi có mồi phosphoryl hóa, giữ lại sợi bổ sung cịn lại.
Trong các phƣơng pháp nêu trên, chúng tôi chọn phƣơng pháp thứ 4: sử dụng enzyme lamda exonuclease nhƣ một enzyme cắt chọn lọc. Nó sẽ cắt vụn những mạch đƣợc phosphoryl hóa của dsDNA từ đầu 5’ đến 3’. Hoạt tính của enzyme này giảm đáng kể đối với ssDNA và những DNA mà không đƣợc
phosphoryl hóa. Trong nghiên cứu của chúng tơi, lamda exonuclease đƣợc sử dụng để tạo sợi đơn sau khuếch đại sản phẩm của mỗi vịng sàng lọc (hình 3.2).
Hình 3.2: Quá trình tạo ssDNA sử dụng enzym lamda exonuclease
Sản phẩm của phản ứng cắt sợi đôi thành sợi đơn đƣợc điện di để kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Mục đích kiểm tra sản phẩm điện di trên gel agarose là để sơ bộ dự đoán đƣợc sự thành công hay không của phản ứng cắt và dự đoán độ tinh sạch của mẫu để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả điện di sợi đơn DNA thu đƣợc sau phản ứng đƣợc trình bày ở hình 3.3.
Hình 3.3: Kết quả tạo ssDNA từ sản phẩm PCR sử dụng enzyme lamda exonuclease
Trong quá trình điện di, EtBr đƣợc sử dụng là thuốc nhuộm để phát hiện DNA dƣới tia UV. Cơ chế hoạt động của chúng là cài xen vào giữa các cặp base của DNA và có tác dụng nhƣ một chất phát huỳnh quang. Chúng có ái lực và hiệu suất huỳnh quang rất cao đối với các phân tử dsDNA. Tuy nhiên đối với những phân tử sợi đơn, chúng có ái lực liên kết yếu và hiệu suất huỳnh quang không cao.
Theo kết quả điện di tại hình 3.3, có thể cho thấy khơng cịn phân tử DNA ở dạng sợi đôi. Tuy nhiên, chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm sau xử lý tạo sợi đơn làm khuôn thực hiện PCR với cặp mồi ApF2/ApR2 để chắc chắn hơn về độ tin cậy của quá trình cắt, để chắc chắn rằng enzyme chỉ cắt 1 sợi. Kết quả PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4: Kết quả PCR sản phẩm sau quá trình cắt tạo sợi đơn
Giếng 1: Sản phẩm PCR sợi đơn với cặp mồi ApF2/ApR2 GiếngM: Thang DNA 100 bp
Hình ảnh điện di cho thấy có một băng sáng đậm có kích thƣớc gần băng 100bp của marker (chỉ thị phân tử) DNA. Điều này chứng tỏ sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ những trình tự có kích thƣớc tƣơng ứng, phù hợp với tính tốn lý thuyết của chiều dài aptamer (khoảng 70bp). Do vậy, có thể kết luận chắc chắn rằng, phản ứng cắt tạo sợi đơn đã thành cơng và sản phẩm thu đƣợc là những trình tự đơn chuỗi sẵn sàng cho vòng sàng lọc kế tiếp.
Nhƣ vây, chúng tôi đã tạo đƣợc thƣ viện aptamer ssDNA mong muốn.
3.1.2. Kết quả sàng lọc aptamer liên kết E. coli O157:H7
Từ thƣ viện aptamer ssDNA tổng hợp, chúng tôi tiến hành sàng lọc aptamer liên kết E. coli O157:H7 theo phƣơng pháp SELEX đã trình bày ở mục phƣơng pháp. Q trình sàng lọc gồm 8 vịng sàng lọc với vi khuẩn đích và 1 vịng sàng lọc loại trừ (đã trình bày ở phần phƣơng pháp). Sau mỗi vòng sàng lọc, dịch giải hấp đƣợc sử dụng làm khuôn cho PCR làm giàu và lặp lại vịng sàng lọc tiếp theo (hình 3.5). Trong quá trình sàng lọc với vi khuẩn đích, nồng độ chất tẩy rửa Tween tăng dần để loại bỏ các aptamer liên kết lỏng lẻo.
Hình 3.5: Kết quả PCR làm giàu sau mỗi vịng sàng lọc với cặp mồi ApF2/ApR2
1– 3: Sản phẩm PCR từ dịch giải hấp với cặp mồi của gen; GiếngM: Thang DNA 100bp.
Kết quả điện di cho thấy: Trên đƣờng chạy xuất hiện vạch băng sáng đậm, so với thang DNA chuẩn thì băng này có kích thƣớc khoảng 70 bp. Nhƣ vậy, có thể khẳng định các bƣớc sàng lọc là ổn định.
Thƣ viện trƣớc khi đƣa vào sàng lọc và sản phẩm sau giải hấp đƣợc đo nồng độ trên máy Nano Drop để kiểm sốt tiến trình của sự làm giàu. Điều kiện phân tách khắt khe với việc tăng nồng độ Tween 20% sau mỗi vòng đƣợc thực hiện để đảm bảo tính chọn lọc cao của aptamer mong muốn (bảng 3.1). Trong ba vòng đầu tiên
Sản phẩm PCR 100 bp
của sàng lọc, phần trăm Tween 20% trong đệm rửa tăng từ 0,1% lên 0,2% rồi 0,5% tƣơng ứng thu đƣợc phần trăm DNA giải hấp giảm từ 12% đến 5,1% và sau đó đến 0,22%. Từ vịng sàng lọc thứ 3 đến vòng sàng lọc thứ 6, phần trăm Tween 20% trong đệm rửa tiếp tục tăng từ 0,7% đến 1,2%; sản phẩm của quá trình làm giàu tăng 13 lần từ 0,22% đến 2,9%. Một sự gia tăng ấn tƣợng đƣợc nhìn thấy ở vịng sàng lọc thứ 7 và sự gia tăng đáng kể có ý nghĩa ở vịng thứ 8. Quá trình sàng lọc đƣợc dừng lại khi phần trăm DNA đặc hiệu E. coli O157:H7 thu đƣợc sau giải hấp đạt 55% so với thƣ viện đƣa vào.
Bảng 3.1: Tóm tắt điều kiện nghiêm ngặt tăng dần cho mỗi vòng sàng lọc
Vòng sàng lọc % Tween trong
đệm rửa % sản phẩm giải hấp so với đầu vào
1 0,1 12 2 0,2 5,1 3 0,5 0,22 4 0,7 0,4 5 1 1,6 6 1,2 2,9 7 1,5 24 8 1,7 55
Để hạn chế tối đa những sản phẩm thu đƣợc sau giải hấp nhƣng không đặc hiệu với E. coli O157:H7, chúng tơi thực hiện vịng sàng lọc loại trừ. Quy trình thực hiện tƣơng tự nhƣ các vịng sàng lọc bình thƣờng, chỉ khác ở chỗ thay vì E. coli
O157:H7, là E. coli thƣờng và sau bƣớc ủ với ssDNA, dịch ủ chứ không phải sản
phẩm giải hấp đƣợc giữ lại cho các thí nghiệm tiếp theo. Sau vịng này, những trình tự có khả năng gắn trực tiếp vào E. coli thƣờng sẽ bị loại bỏ.
Sau 8 vịng sàng lọc với vi khuẩn đích và 1 vịng sàng lọc loại trừ, chúng tôi thu đƣợc một hỗn hợp ssDNA có khả năng gắn kết với vi khuẩn đích. Trong hỗn hợp ssDNA này bao gồm nhiều phân tử ssDNA có trình tự khác nhau cũng nhƣ khả năng liên kết với vi khuẩn đích là khác nhau. Chính vì vậy, cơng việc tiếp theo của
chúng tôi là chọn ra đƣợc 1 vài aptamer có khả năng liên kết đặc hiệu nhất với vi khuẩn đích. Để giải quyết vấn đề này, sản phẩm sau sàng lọc đã đƣợc tủa lại để chuẩn bị cho q trình tách dịng và chọn dịng aptamer liên kết đặc hiệu vi khuẩn
E. coli O157:H7.
Nhƣ vậy, kết thúc quá trình sàng lọc 9 vịng, chúng tơi thu đƣợc hỗn hợp các aptamer ssDNA có khả năng liên kết E. coli O157:H7.
3.2. Kết quả tách dòng aptamer liên kết vi khuẩn E. coli O157:H7
Để tìm đƣợc phân tử aptamer có khả năng gắn tốt nhất với E. coli O157:H7 trong hỗn hợp các aptamer ssDNA vừa thu đƣợc trên, chúng tơi tiến hành tách dịng và chọn dòng aptamer liên kết đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7. Quá trình tách dịng đƣợc tiến hành theo hình 3.6.
Hình 3.7: Quy trình tách dòng aptamer ssDNA liên kết vi khuẩn E. coli O157:H7
3.2.1. Nhân bản trình tự aptamer ssDNA liên kết vi khuẩn E. coli
O157:H7
Dịch sàng lọc sau vòng loại trừ đƣợc đƣa vào quy trình tách dịng (hình 3.7) và xác định trình tự. Đầu tiên, cần tiến hành PCR để tăng số bản sao của aptamer
Gắn sản phẩm PCR vào vecto pCR 2.1 - TOPO
Tinh sạch sản phẩm PCR
Phân tích điện di trên gel agarose Nhân bản Aptamer liên kết E.coli
O157:H7
Hỗn hợp Aptamer ssDNA liên kết
E.coli O157:H7
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α
Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli
Táchđƣợc các dòng Aptamer liên kếtvi khuẩn E.coli O157:H7
ssDNA gắn với vi khuẩn E. coli O157:H7. Sau đó phân tích điện di trên gel agarose, chúng tơi thu đƣợc kết quả trên hình 3.8.
M 1
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR
Giếng 1: Sản phẩm PCR aptamer ssDNA liên kết vi khuẩn E. coli O157:H7 Giếng M: Thang DNA 100 bp
Sau khi hoàn thành bƣớc khuếch đại trình tự liên kết, chúng tơi tiến hành tách dịng những đoạn gen này. Q trình tách dịng đƣợc thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1 – TOPO (Invitrogen), sau đó biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α để chọn lọc dòng tái tổ hợp mang đoạn gen gắn đặc hiệu với E. coli O157:H7.
3.2.2. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR 2.1 – TOPO
Sử dụng Vector pCR 2.1 – TOPO để tiến hành tách dòng. Vector pCR 2.1 – TOPO có các đặc điểm sau:
- Có một vùng Ori giúp vector độc lập sao chép trong tế bào chủ.
- Có chứa các gen kháng kháng sinh là ampr (ampicillin) và kar (kanamycin) nhƣ là các dấu chuẩn chọc lọc, cho phép các dòng vi khuẩn mang vector mọc trên môi trƣờng chứa các kháng sinh này. Ngồi ra, chúng cịn chứa gen mã hóa cho
100 bp
enzyme β – Galactosidase, có khả năng chuyển hóa cơ chất X – Gal, giúp chọn lọc một cách dễ dàng do phản ứng tạo màu.
- Mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số enzyme giới hạn. Vector có 17 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn nhƣ: E.coRI, HinIII, NsiI, KprI, SacI, bamHI, SpeI, BstXI, E.coRV, NetI, AraI, PaeI, XhoI, XbaI, ApaI riêng E.coRI và BstXI có hai vị trí cắt.
Trong phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1, enzyme
topoisomerase (có trong bộ TA Cloning Kit) sẽ bám vào chuỗi kép DNA tại một vị
trí đặc hiệu và cắt bỏ liên kết phosphodieste ở đầu 5’ – CCCTT trên một chuỗi đơn của vector, đồng thời tạo nên liên kết cộng hóa trị giữa gốc phosphat đầu 3’ của chuỗi vừa bị cắt với tyrosyl tại vị trí 274 của enzyme topoisomerase bằng chính năng lƣợng liên kết phosphodieste. Trong khi đó, dƣới tác dụng của enzyme Taq DNA polymerase một gốc adenin tự do đầu 3' đƣợc gắn trên sản phẩm của PCR mà
khơng phụ thuộc vào trình tự khn. Nhƣ vậy, sản phẩm có thể dễ dàng gắn vào vector đã có sẵn một gốc thymine trên đầu 5’. Tiếp theo liên kết giữa gốc phosphat của DNA và Tyrosyl của enzyme bị phá vỡ nhờ tác động của nhóm 5’ – OH của sợi đơn đã bị cắt trƣớc đó, điều này sẽ làm chuyển hƣớng phản ứng và giải phóng enzyme topoisomerase (hình 3.9).
Hình 3.9: Cơ chế hoạt động của TA Cloning kit. (Nguồn: Invitrogen) Enzyme Topoisomeraza
bám vào ví trí đặc hiệu
Vector pCR2.1 - TOPO
Sản phẩm PCR khuếch đại với Taq Polymeraza
Phản ứng gắn hoàn thành
Enzyme Topoisomeraza đƣợc giải phóng Ủ 25 phút
3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α
Vi khuẩn E. Coli DH5α sau khi đƣợc xử lý bằng CaCl2 giúp màng tế bào trở nên xốp, giúp cho vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR) có thể xâm nhập vào tế bào một cách dễ dàng hơn. Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (420
C trong 60 giây) nhằm kích thích sự biến nạp plasmid vào trong tế bào. Sau đó tế bào đƣợc cấy trải lên môi trƣờng dƣỡng chất, giúp cho tế bào hồi phục, nhờ sự trợ giúp của bộ máy tổng hợp trong tế bào mà plasmid tiến hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein tƣơng ứng. Gen kháng kháng sinh đƣợc chọn làm dấu hiệu chọn lọc để phân biệt những tế bào có tiếp nhận DNA plasmid trong số những tế bào không tiếp nhận. Tồn bộ q trình tiến hành thực hiện nhƣ đã trình bày trong mục 2.2.7. Kết quả biến nạp đƣợc thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10: Kết quả biến nạp vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR)vào tế bào E. coli DH5α
Trong môi trƣờng chọn lọc bằng kháng sinh nhƣ trên có thể xảy ra 3 trƣờng hợp:
Trƣờng hợp 1: Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp nên không sinh trƣởng đƣợc.
Trƣờng hợp 2: Tế bào vi khuẩn nhận plasmid nhƣng không biểu hiện gen kháng kháng sinh nên không sinh trƣởng đƣợc.
Trƣờng hợp 3: Tế bào vi khuẩn nhận đƣợc plasmid tái tổ hợp và biểu hiện gen kháng kháng sinh nên sinh trƣởng đƣợc.
Chỉ những tế bào nhận vector tái tổ hợp (đã gắn sản phẩm PCR) mới có thể sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc bằng kháng sinh, do plasmid có chứa và
biểu hiện gen kháng kháng sinh. Chúng tơi tiến hành chọn dịng tế bào mang vector tái tổ hợp chứa aptamer đích bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Kết quả chúng tôi chọn đƣợc 8 khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp mang aptamer đích (hình 3.11).
Hình 3.11: Kết quả PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi ApF2/ApR2
Giếng 1 – 8: Sản phẩm PCR với cặp mồi ApF2/ApR2 từ các khuẩn lạc số 1-8
tương ứng
GiếngM: Thang DNA 100 bp
3.2.4.Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli
Các dịng khuẩn lạc đã chọn ở trên đƣợc ni cấy trong mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh kar để qua đêm ở tủ lắc 370C, 200 v/ph để nhân lên với số lƣợng lớn. Sau khi tách chiết theo quy trình nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.8, chúng tôi lấy 5μl dịch plasmid tách từ mỗi khuẩn lạc hòa trong H2O để điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di đƣợc thể hiện ở hình 3.12.
Hình 3.12: Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp mang Apamer liên kết
E. coli O157:H7
Giếng 1 – 8: Plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc số 1- 8
Kết quả sau khi chạy điện di cho thấy 3 băng đậm, rõ nét, thể hiện 3 trạng thái khác nhau của plasmid. Điều này chứng tỏ quá trình chiết tách và tinh sạch DNA plasmid đã thành cơng, loại bỏ hồn tồn RNA và plasmid .
Nhƣ vậy, chúng tôi đã tách đƣợc 8 dòng aptamer ssDNA liên kết E. coli