CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U
2.2.2.5. Xác định độ nhạy của phản ứng PCR
Sử dụng mẫu DNA vi khuẩn C.trachomatis đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi KL5/KL6, đoạn DNA đƣợc khuếch đại có kích thƣớc 288 bp thuộc trình tự plasmid của vi khuẩn C.trachomatis. Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại đƣợc chèn vào vector pJet1.2/blunt (CloneJETTM
PCR Cloning kit - Fermentas) tạo plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp có mang đoạn DNA của vi khuẩn C.trachomatis đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli chủng Top 10F’ni qua đêm. Sau đó plasmid tái tổ hợp đƣợc tinh sạch bằng từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kít GeneJETTM plasmid miniprep kit –
Fermentas. Xác định nồng độ plasmid tái tổ hợp sau khi tinh sạch bằng cách đo khả năng hấp thụ bƣớc sóng 260nm trên máy Biophotometer (Eppendorf). Dựa vào nồng độ plasmid tái tổ hợp có thể tính đƣợc số bản sao plasmid trên một đơn vị thể tích theo cơng thức [35]:
N= (6.022*1023)*C/(650*109*3262)
Trong đó: 6.022*1023 là số bản copi plasmid trong 1 mole (định luật Avogadro) C là nồng độ plasmid (ng)
650 là khối lƣợng 1 mole của một cặp base (gr) = 650*109ng
3262 là chiều dài của plasmid (bao gồm plasmid có kích thƣớc 2974 bp và đoạn chèn kích thƣớc 288 bp).
Sau đó, mẫu plasmid tái tổ hợp có mang đoạn DNA của vi khuẩn C.trachomatis
đƣợc pha lỗng thành các dung dịch có các nồng độ từ 1010, 109, 108, 107,... đến 101 bản sao plasmid/µl và sƣ̉ du ̣ng làm mẫu chuẩn để đánh giá đô ̣ nha ̣y của phản ƣ́ng.
Phản ứng PCR đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X và các loại mồi, 0.05 U UNG, thực hiện với mẫu chứng dƣơng plasmid có nồng độ khác nhau: 101
, 102, 103,104 bản sao/µl và sử dụng 10 µl để điện di trên gel agarose 1%. Chu trình nhiệt của cặp mồi KL5/KL6: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Chu trình nhiệt với cặp mồi KL1/KL2: biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.