STT Tên Trình tự (5'-3') Độ dài Tm
1 Pwo-
BamHI GCggatccATTCTGGATGTGGATTATATCAC 31 bp 53.75
2 Pwo-
EcoRI CGgaattcTTAGCTTTTCTTAATGTTCAGC 30 bp 53.07
Thết kế mồi nhân gen Pwo DNA polymerase chứa vị trí cắt enzyme giới hạn
Cặp mồi sử dụng để nhân dịng được thiết kế chính xác ở hai đầu đoạn gen mã hóa Pwo DNA polymerase. Mồi xi được xác định nằm ở đầu 5’ trên mạch bổ sung (positive strand – cùng chiều phiên mã với f1 origin) của đoạn gen đích gắn với trình tự cắt giới hạn của enzyme BamHI. Mồi ngược nằm tương ứng ở đầu 5’
trên mạch khn (negative strand) của đoạn gen đích gắn với trình tự cắt giới hạn của enzyme EcoRI. Sau đó, trình tự gen và mồi được tổng hợp theo phương pháp
hóa học bởi Cơng ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa (PHUSA Biochem). Gen tổng hợp được chèn vào vector PUC19, bảo quản ở -20oC.
2.2.2. Nhân dịng, tạo vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase
Vector tổng hợp PUC19-Pwo (Sản phẩm PCR) 5’-ggatcc-Gen Pwo-gaattc-3’ (1) PCR BamHI/EcoRI primers Điện di DNA pEtM (5453bp) Restriction enzyme Ligase Điện di sản phẩm cắt nối
(2) Tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo
(3) Biến nạp BL21 (DE3)
(4) Tách plasmid pEtM-Pwo
Điện di plasmid Bảo quản
(5) Giải trình tự Kiểm tra khung đọc
(1) PCR nhân gen Pwo DNA polymerase
Gen mã hóa Pwo DNA polymerase được khuếch đại bằng phương pháp PCR sử dụng khuôn plasmid PUC19-Pwo nhận từ công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa (PHUSA Biochem). Tiến hành phản ứng PCR theo thành phần như trong bảng 7. Chu trình nhiệt độ cho phản ứng lần lượt với giai đoạn biến tính ban đầu 98oC/2 phút; 35 chu kỳ lặp lại của các bước biến tính 98oC/30 giây, gắn mồi 60oC/15 giây, kéo dài 72oC/1 phút; giai đoạn kéo dài cuối cùng 72oC/5 phút.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, chạy điện đi 100V, 30 phút. Bản gel được ngâm trong dung dịch chứa thuốc nhuộm ethidium bromide (EtBr), soi gel dưới đèn UV và chụp ảnh bởi hệ thống camera AlphaImager MINI (của Mỹ).