CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp QuEChERS
Phương pháp QuEChERS dựa trên nguyên tắc chiết mẫu một lần bằng axetonitril đã được ổn định pH và tách khỏi nước có trong mẫu bằng phân bố lỏng- lỏng nhờ muối magie sunfat (MgSO4). Quá trình làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-SPE) được dùng để loại các axit hữu cơ, nước còn dư và các thành phần khác nhờ phối hợp chất hấp phụ PSA và MgSO4. C18 và GCB được sử dụng khi cần thiết để lần lượt loại các chất béo và clorophyl.Dịch chiết được tách và phân tích bằng sắc ký khối phổ [2].
Phương pháp này tối thiểu hóa các bước chuẩn bị mẫu, giảm sử dụng dung mơi hóa chất độc hại, tách chiết HCBVTV từ mẫu đồng nhất trong vòng chưa đầy 30 phút, đồng thời giảm chi phí thử nghiệm. Kỹ thuật QuEChERS hiện nay là cơ sở cho các phương pháp thử được thừa nhận rộng rãi trên thế giới và đang được các phịng thí nghiệm ở Việt Nam áp dụng [2].
Việc mở rộng phương pháp QuEChERS cho thấy sự ưu việt của nó khơng chỉ trong việc tách chiết cũng như làm sạch mẫu mà còn giải quyết được mối quan tâm về việc phát hiện một mảng lớn các loại hóa chất trừ sâu, hóa chất diệt cỏ, hóa chất diệt nấm, thuốc kháng sinh và các hợp chất khác trong tồn bộ q trình tạo nguồn cung cấp thực phẩm.Có ba phương pháp QuEChERS căn bản là phương pháp QuEChERS nguyên bản; Phương pháp QuEChERS AOAC 2007.01 và Phương pháp QuEChERS EN15662.
Các bước của phương pháp QuEChERS được tóm tắt như sau:
- Cân 10 – 15 gam/mẫu vào ống ly tâm loại 50 mL có nắp kín. Với mẫu có hàm lượng nước thấp như chè, gạo, ngũ cốc thì cần thêm nước vào để hàm lượng nước > 75% để trong 2 h.
- Thêm 10 mL axetonitril, rung lắc mạnh khoảng 2 – 3 phút. Sau đó thêm MgSO4, NaCI, hỗn hợp muối đệm xitrat Na3C6H5O7 và Na2C6H6O7 sao cho pH mẫu đạt 5 -5,5.
- Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút để pha hữu cơ được phân tách. Thu pha hữu cơ và thêm các chất hấp phụ amin như PSA, than hoạt tính (GCB) để làm sạch loại bỏ cơ chất thực vật, chất diệp lục. Tiến hành ly tâm lần nữa, thu lấy pha hữu cơ đem thổi khơ bằng khí N2. Tùy thuộc thiết bị phân tích là hệ GC-MS/FPD/µECD hay HPLC-MS/MS mà định mức bằng dung mơi thích hợp.
- Mẫu được phân tích tại phịng thí nghiệm của Trung tâm Quan trắc Tài ngun và Mơi trường tỉnh Hà Nam.
Hình 2.1: Quy trình phân tích HCBVTV trong rau quả
Mẫu (>1 kg) được cắt nhỏ ra, lấy khoảng 200 g mẫu đại diện và đồng nhất bằng thiết bị đồng nhất mẫu
Chuyển 10 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL
Thêm 10 mL ACN +1g Na3C6H5O7 .1,5 H2O + 1 g NaCl + 0,5 g Na2C6H6O7. 2H2O +4 g MgSO4
Lắc mạnh trong khoảng 2-3 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút và trong 5 phút
Chuyển 4 mL vào ống ly tâm 15 mL trong đó đã có 100 mg MgSO4+30 mg PSA/mL dịch chiết và lắc trong khoảng 30 giây
Ly tâm 3000 vòng/phút trong khoảng 5 phút
Chuyển 2 mL dịch chiết vào vial 2 mL và thêm 5% axit focmic và lắc đều
Việc đồng nhất mẫu nhằm mục đích tăng diện tích bề mặt, thuận lợi cho q trình tách chiết. Trong q trình này sinh ra nhiệt có thể làm mất đi HCBVTV, ảnh hưởng đến kết quả phân tích, nên mẫu được đồng nhất trong điều kiện đông lạnh (vừa rã đông).
Sử dụng dung môi axetonitril trong phương pháp QuEChERS bởi vì nó có nhiều đặc điểm thuận lợi nhất cho việc tách chiết ở phạm vi rộng nhất các HCBVTV. Chẳng hạn như so sánh với dung mơi axeton hay etylaxetat thì khi thêm hỗn hợp muối, dung môi và nước dễ dàng tách khỏi nhau hơn là axeton. Etylaxetat có thể hịa trộn một phần với nước nhưng lại chiết luôn cả chất béo và sáp từ nền mẫu, cho độ thu hồi thấp đối với hóa chất trừ sâu ở dạng axit, bazơ. Dung môi ACN chiết không tốt với các chất dễ tan trong mỡ, nhưng với những mẫu có hàm lượng đường cao thì ACN và nước dễ dàng hình thành hai pha để chiết các hoạt chất trong HCBVTV lên pha hữu cơ. So với axeton thì ACN dễ loại nước hơn khi thêm MgSO4. Dung mơi ACN thích hợp cho cả sắc ký lỏng và sắc ký khí. Do vậy trong phương pháp QuEChERS lựa chọn dung môi ACN để chiết các hoạt chất BVTV. Tuy nhiên dung mơi này có một nhược điểm là khó bay hơi hơn nên thời gian cô quay làm giàu mẫu sẽ lâu hơn.
Muối và hệ đệm thêm vào để cân bằng pH của dung dịch, bảo vệ chất phân tích.
MgSO4 tạo điều kiện khắc nghiệt để HCBVTV không liên kết được vào cơ chất với quá trình sinh nhiệt mạnh.
Trước đây bước làm sạch thực hiện dựa trên việc nhồi chất hấp thụ lên cột sắc ký. Nhưng trong phương pháp này, phần dung dịch chiết được cho vào ống nhỏ có chứa một lượng nhỏ PSA (amin bậc 2), lắc đều sau đó ly tâm để tách phần dung dịch và chất rắn hấp thu. Chất hấp thu chỉ giữ lại thành phần nền mẫu, không giữ các HCBVTV. Trong trường hợp mẫu chứa nhiều chất béo thì thêm bột C18 vào để loại các chất béo, mẫu chứa nhiều chất màu trong thực vật thì thêm cacbon hoạt tính GCB.Cách làm sạch này so với chiết SPE thì dễ thực hiện hơn, khơng phải hoạt hóa cột, và dùng ít dung mơi.
Sau khi tiếp xúc với PSA, pH của dung dịch chiết tăng lên đến giá trị >8, do đó ảnh hưởng đến sự ổn định của HCBVTV. Nếu dung dịch chiết suất được axít hóa xuống pH = 5 thì chất sẽ ổn định hơn và có thể lưu giữ trong vài ngày. Ngoài ra, axit focmic cịn có tác dụng đẩy HCBVTV ra khỏi cơ chất thực vật, tăng hiệu quả cho phân tích.