Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1. Địa điểm nghiên cứu

Khoa Khám bệnh, Khoa xét nghiệm Bệnh viện trường Đại học Y khoa Thái Nguyên.

2.2.2. Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 5 năm 2016 đến tháng 12 năm 2016.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả, thiết kế nghiên cứu cắt ngang (cross – sectional study), so sánh giữa nhóm bệnh nhân ĐTĐ có THA với nhóm bệnh nhân ĐTĐ khơng THA.

2.3.2. Cỡ mẫu

Công thức tính cỡ mẫu theo cơng thức tính cỡ mẫu cho việc kiểm định sự khác nhau giữa hai giá trị trung bình:

n = x Z2 (α,β) Trong đó: n : cỡ mẫu tối thiểu

: Độ lệch chuẩn (ước tính theo một nghiên cứu trước). Dựa trên nghiên của của Dương Thị Tuyết [36], trong nghiên cứu này chứng tôi lấy =6.

: Sự khác biệt về giá trị trung bình giữa 2 nhóm nghiên cứu theo mong muốn của nghiên cứu, chúng tôi lấy  = 4.

22

α: mức ý nghĩa thống kê β: sai sót loại II cho phép

Z2 (α,β) được tra từ bảng = 10,5

Thay vào công thức trên, cỡ mẫu tối thiểu được tính cho nhóm bệnh là 47. Trong nghiên cứu này chúng tôi dự kiến lựa chọn 60 bệnh nhân để đảm bảo tính chính xác của các phép so sánh, trong đó có 30 BN ĐTĐ khơng THA và 30 BN ĐTĐ có THA.

2.4. Chỉ tiêu nghiên cứu

2.4.1. Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân nghiên cứu

- Tuổi - Giới tính - Nghề nghiệp - Dân tộc - Địa chỉ - Thời gian mắc bệnh 2.4.2. Chỉ tiêu lâm sàng - Huyết áp - Chiều cao - Cân nặng - Chỉ số BMI 2.4.3. Chỉ tiêu cận lâm sàng

- Định lượng nồng độ glucose huyết tương theo qui trình chuẩn - Xác định tỷ lệ HbA1C trong máu toàn phần

- Định lượng nồng độ một số thành phần lipid huyết tương (cholesterolTP, triglycerid, HDL-C, LDL-C)

- Định lượng nồng độ homocystein huyết tương

2.5. Tiêu chuẩn chẩn đoán và cách đánh giá 2.5.1. Chẩn đoán đái tháo đƣờng 2.5.1. Chẩn đoán đái tháo đƣờng

được xác định khi thỏa mãn 1 trong 4 điều kiện sau [40]: + HbA1C ≥ 6,5 % (1).

+ lúc đói (sau khi nhịn ăn > 8 giờ) ≥ 7 mmol/l (126 mg/dl) (2).

+ ≥ 11,1 mmol/l (200 mg/dl) ở thời điểm sau 2 giờ làm nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đường uống 75 gam glucose (3).

+ bất kỳ ≥ 11,1 mmol/l (200 mg/dl) kèm theo các triệu chứng lâm sàng cổ điển: đái nhiều, uống nhiều, sút cân.

Trong những trường hợp bệnh cảnh khơng cấp tính hoặc khơng có mất bù chuyển hóa, cần lặp lại các tiêu chí (1), (2), (3) vào một ngày khác để chẩn đoán xác định.

* Chẩn đoán ĐTĐ týp 2: Dựa trên tiêu chuẩn phân loại ĐTĐ của WHO và vận dụng cho phù hợp điều kiện Việt Nam như sau [40]:

- Thường gặp ở người trên 30 tuổi. - Bệnh khởi phát và tiến triển từ từ.

- Thể trạng thường béo tại thời điểm hiện tại hoặc trước đó, cũng có thể gầy.

- Nồng độ glucose máu thường tăng vừa phải. - Ít có xu hướng nhiễm toan xeton.

- Tổn thương vi mạch thường xuất hiện sớm. - Nồng độ insulin máu tăng hoặc bình thường.

- Glucose máu có thể ổn định khi thực hiện một hay phối hợp nhiều biện pháp điều trị như: chế độ ăn, tập thể dục, thuốc hạ glucose máu bằng đường uống.

2.5.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán rối loạn lipid máu

Theo khuyến cáo của Hội tim mạch học Việt Nam (2008) khi có một trong số nồng độ một số thành phần lipid trong máu đạt tiêu chuẩn sau [14]

- CholesterolTP ≥5,2 mmol/l - Triglycerid ≥ 1,7 mmol/l - LDL-C≥3,34 mmol/l

- HDL-C < 1,03 mmol/l

2.5.3. Chẩn đoán THA và phân độ THA

Theo tiêu chuẩn JNC VI (Joint National Committee VI) khi huyết áp tâm thu (HATT) ≥ 140 mmHg và huyết áp tâm trương (HATTr) ≥ 90 mmHg [3].

Bảng 2.1. Phân loại tăng huyết áp theo JNC VI

Mức độ Huyết áp tâm thu

(mmHg) Huyết áp tâm trƣơng (mmHg) Bình thường < 130 Và < 85 Tiền THA 130 – 139 Và 85 – 89 Tăng huyết áp: Độ I Độ II Độ III 140 - 159 160 -179 > 180 Hoặc Hoặc Hoặc 90 - 99 100-110 >110

2.5.4. Chẩn đoán tăng Hcy máu

Bảng 2.2. Phân loại tăng homocystein huyết tương [32]

Bình thường Tăng nhẹ Tăng vừa Tăng nặng Hcy(μmol/L) 5-15 16-30 31-100 >100

2.5.5. Tiêu chuẩn đánh giá kiểm soát glucose

Bảng 2.3. Tiêu chuẩn kiểm soát glucose theo Hiệp hội đái tháo đường châu Á – Thái Bình Dương năm 2005 [92]

Chỉ số Tốt Chấp nhận Kém

Glucose (mmol/L) 4,4 - 6,1 6,2 - 7,0 > 7 HbA1C (%) < 6,5 6,5 – 7,5 > 7,5

2.5.6. Đánh giá chỉ số khối cơ thể

[93]. - Gầy: BMI < 18,5 - Bình thường: BMI 18,5 – 22,9 - Thừa cân: 23 - 24,9 - Béo phì độ 1: BMI 25 – 29,9 - Béo phì độ 2: BMI ≥ 30 2.6. Thiết bị, hóa chất 2.6.1. Thiết bị

- Máy xét nghiệm hóa sinh tự động OLYMPUS AU 480 của hãng Beckman Coulter

- Máy ly tâm Erba

- Pipet tự động thể tích 1000μl, 25 μl

2.6.2. Hóa chất

- Kit định lượng Homocystein của Dialabs - Kit định lượng HbA1C của Beckman Coulter

- Kit định lượng glucose, cholesterolTP, triglycerid, HDL-C, LDL-C của Beckman Coulter

2.6.3. Chất liệu nghiên cứu

Bệnh nhân được lấy máu để xác định các chỉ tiêu cận lâm sàng vào buổi sáng, trước uống thuốc hạ glucose máu.

Máu của đối tượng nghiên cứu được lấy vào buổi sáng, lúc đói. Máu được chống đông bằng heparin. Đầu tiên lấy máu tồn phần để xác định tỷ lệ HbA1C, sau đó ly tâm lấy huyết tương để xác định nồng độ homocystein, glucose và một số thành phần lipid huyết tương.

2.7. Phƣơng pháp thu thập số liệu 2.7.1. Phỏng vấn

Hỏi tiền sử, bệnh sử, các yếu tố liên quan đến bệnh theo mẫu phiếu điều tra đã được chuẩn bị trước. Các kết quả được ghi vào phiếu điều tra.

2.7.2.1. Đo huyết áp

Sử dụng ống nghe và huyết áp kế.

Cách đo: buổi sáng khi bệnh nhân đến khám bệnh, bệnh nhân không sử dụng các chất ảnh hưởng đến huyết áp như bia, rượu, cà phê, thuốc lá… Bệnh nhân được nghỉ ít nhất 5 phút trước khi đo. Đo ở tư thế ngồi, cởi bỏ áo chật, cánh tay để tựa trên bàn ngang mức tim, thả lỏng tay và khơng nói chuyện trong khi đo. Quấn băng huyết áp sao cho mép dưới băng trên lằn khuỷu 3cm. Sau khi áp lực hơi trong băng quấn làm mất mạch quay, bơm hơi lên thêm 30mmHg nữa rồi xả từ từ 2mmHg/giây. Sử dụng âm thanh pha I và pha V của Korotkoft để xác định huyết áp.

2.7.2.2. Cân bệnh nhân

Sử dụng cân bàn có thước đo chiều cao. Bệnh nhân chỉ mặc một bộ quần áo mỏng, không đi giầy dép, không đội mũ. Cân được đặt ở vị trí bằng phẳng, chính về mức 0. Kết quả được ghi bằng kg, sai số không quá 100g.

2.7.2.3. Đo chiều cao

Được đo bằng thước đo chiều cao gắn liền với cân. Bệnh nhân đứng thẳng đứng, 2 gót chân sát mặt sau của bàn cân, đầu thẳng, mắt nhìn thẳng. Kéo thước đo thẳng đứng đến hết tầm, sau đó kéo từ từ xuống đến khi chạm đúng đỉnh đầu, đọc kết quả trên vạch thước đo. Kết quả tính bằng mét (m) và sai số không quá 0,5 cm.

2.7.3. Kỹ thuật định lƣợng các chỉ tiêu cận lâm sàng

Các xét nghiệm sinh hóa máu được tiến hành trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động AU 480 tại khoa khám bệnh Bệnh viện trường Đại học Y khoa Thái Nguyên.

2.7.3.1. Định lượng nồng độ glucose huyết tương

Xét nghiệm bằng phương pháp hexokinase trên hệ thống máy sinh hóa tự động AU480 của hãng Beckman Coulter .

Nguyên lý:

của adenosine triphosphate (ATP) và các ion Mg2+ tạo thành glucose-6- phosphate và adenosine diphosphate (ADP). Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6P-DH) oxy hóa đặc hiệu glucose-6-phosphate tạo thành gluconate-6-phosphate cùng với sự giảm đồng thời của nồng độ NAD+ để tạo NADH. Sự gia tăng độ hấp thụ của NADH được đo ở bước sóng 340nm tỷ lệ thuận với nồng độ glucose trong mẫu đo.

Glucose + ATP Glucose-6-phosphate + ADP

Glucose-6-phosphate + NAD+ Gluconat-6-phosphat + NADH + H+ Giá trị tham chiếu của glucose huyết tương : 3,9 –5,5 mmol/l

2.7.3.2. Định lượng nồng độ cholesterolTP huyết tương

Xét nghiệm cholesterolTP huyết tương bằng phương pháp enzym so màu trên hệ thống máy sinh hóa tự động AU480 của hãng Beckman Coulter .

Nguyên lý:

Thủy phân cholesterol este bằng enzym cholesterol esterase (CHE) và oxy hóa bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quinoneimine tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxid (H2O2) với 4-aminophenazone và phenol nhờ sự xúc tác của peroxidase (POD). Sự tăng độ hấp thụ quang do sự hình thành phức hợp có màu đỏ quinoinemine được đo ở bước sóng 540/560 nm. So sánh với chuẩn tính được nồng độ cholesterol trong mẫu.

Cholesterol estes + H2O Cholesterol + Acid béo tự do

Cholesterol + O2 Cholesten-3-one + H2O2

2 H2O2 + Phenol + 4 aminoantipyrine Quinoneimin + 4 H2O Giá trị tham chiếu của cholesterolTP huyết tương: 3,9 - 5,2 mmol/L.

2.7.3.3. Định lượng HDL- C huyết tương

HK, Mg2+

G6P-DH

CHE

CHO

Xét nghiệm HDL-C huyết tương bằng phương pháp enzym so màu trực tiếp trên hệ thống máy sinh hóa tự động AU480 của hãng Beckman Coulter.

Nguyên lý:

Loại bỏ và phá hủy LDL, VLDL, Chylomycron bằng phản ứng enzym đặc hiệu. Sau đó, thực hiện phản ứng tạo màu đặc hiệu với HDL-C. Đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm, sự tăng độ hấp thụ quang do hình thành phức hợp màu tỷ lệ với nồng độ HDL-C trong mẫu.

HDL-Cholesterol + H2O + O2 4-Cholesten-3-one + acid béo + H2O2

H2O2 + 4-aminoantipyrin + F-DAOS Phức hợp màu xanh + F- + H2O Giá trị tham chiếu của HDL- C huyết tương ≥ 1,03 mmol/L

2.7.3.4. Định lượng LDL-C huyết tương

Xét nghiệm LDL-C huyết tương bằng phương pháp enzym so màu trực tiếp trên hệ thống máy sinh hóa tự động AU480 của hãng Beckman Coulter.

Nguyên lý:

Loại bỏ và phá hủy HDL, VLDL, chylomycron bằng phản ứng enzym đặc hiệu. Sau đó, thực hiện phản ứng tạo màu đặc hiệu với LDL-C. Đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm, sự tăng độ hấp thụ quang do hình thành phức hợp màu tỷ lệ với nồng độ LDL-C trong mẫu.

LDL-Cholesterol + H2O + O2 4-Cholesten-3-one + acid béo + H2O2

H2O2 + 4-AA + HDAOS Phức hợp màu xanh + OH- + H2O Giá trị tham chiếu của LDL-C huyết tương là < 3,3 mmol/L.

2.7.3.5. Định lượng triglycerid huyết tương

Xét nghiệm triglycerid huyết tương bằng phương pháp enzym so màu trên hệ thống máy sinh hóa tự động AU480 của hãng Beckman Coulter.

Nguyên lý:

CHE, CHO POD

CHE, CHO POD

Triglycerid được định lượng dựa trên một loạt các phản ứng enzym. Các chất béo trung tính trong mẫu được thủy phân bởi lipase cho glycerol và acid béo. Glycerol được phosphoryl hóa bởi adenosine triphosphate (ATP) nhờ glycerol kinase (GK) tạo thành glycerol-3-phosphate. Glycerol-3-phosphate bị oxy hóa bởi oxy phân tử với sự xúc tác của GPO (glycerol phosphate oxidase) để tạo ra hydrogen peroxide (H2O2) và dihydroxyacetone phosphate. H2O2 hình thành phản ứng với 4-aminophenazone và N,N-bis(4-sulfobutyl)-3,5- dimethylaniline, muối dinatri (MADB) với sự có mặt của peroxidase (POD) tạo ra sản phẩm màu, được đo ở bước sóng 660/800nm. Sự gia tăng độ hấp thụ quang tỷ lệ thuận với nồng độ triglycerid trong mẫu.

Lipase

Triglycerid Glycerol + Acid béo tự do

GK, Mg2+

Glycerol + ATP Glycerol-3-phosphat + ADP GPO

Glycerol + O2 Dyhydroxyaceton-P + H2O POD

H2O + 4 Amino antipyrin + MADB Phức hợp màu xanh + H2O Giá trị bình thường của triglycerid < 1,7 mmol/L

2.7.3.6. Định lượng HbA1C máu toàn phần

Xét nghiệm HbA1C máu toàn phần bằng phương pháp miễn dịch đo độ đục trên hệ thống máy sinh hóa tự động OLYMPUS AU480 của hãng Beckman Coulter.

Nguyên lý:

Xác định nồng độ của 2 chỉ số HbA1C và Hemoglobin, tỷ số HbA1C/Hemoglobin thể hiện tỷ lệ HbA1C(%). Các tế bào máu được ly giải và chuỗi Hemoglobin được thủy phân bởi protease trong thuốc thử. Hemoglobin được đo thông qua việc chuyển đổi tất cả các dẫn xuất hemoglobin thành

hematin trong dung dịch kiềm của một chất tẩy không ion. Hemoglobin cho phức hợp màu xanh, được đo ở bước sóng 600. HbA1C được đo trong các hạt ức chế khảo nghiệm, một chất ngưng kết bao gồm một polime tổng hợp gồm nhiều bản sao của thành phần miễn dịch phản ứng, gây ngưng kết hạt latex khống thể dơn dịng của chuột. Sự hiện diện của HbA1C trong mẫu là kết quả của việc giảm ngưng kết của HbA1C R1 và ngưng kết HbA1C R2. Đo mật độ quang ở bước sóng 700 nm. Sự gia tăng độ hấp thụ tỷ lệ nghịch với nồng độ HbA1C trong mẫu.

Giá trị bình thường: HbA1C máu 4,0-6,2%

2.7.3.7. Định lượng homocystein huyết tương

Xét nghiệm homocysteine huyết tương bằng phương pháp động học enzyme trên hệ thống sinh hóa tự động AU480 của hãng Beckman Coulter.

Nguyên lý:

Hcy toàn phần (gồm Hcy tự do và Hcy kết hợp) được chuyển thành Hcy tự do sau đó kết hợp với một đồng yếu tố để tạo thành S adenosin methionin (SAM) dưới tác dụng của Hcy S methyltransferase để tạo thành methionin (sản phẩm chuyển hóa của Hcy) và S-adenosyl-L-Hcy (SAH) hydrolase. SAH được chuyển hóa nhờ các enzym SAH hydrolase, adenosin deaminase và glutamat dehydrogenase. Dưới tác dụng của SAH hydrolase SAH bị thủy phân thành adenosin và Hcy. Adenosin được tạo thành tiếp tục bị thủy phân thành inosin và amonia. Amonia tạo thành sẽ phản ứng với NADH dưới tác dụng của glutamat dehydrogenase tạo thành NAD+. Nồng độ Hcy trong mẫu bệnh phẩm tỷ lệ thuận với lượng NADH biến đổi thành NAD+.

Hcy-methyltransferase

Homocysteine + SAM Methionine + SAH

SAH Adenosine + Hcy

Adenosine inosine + NH3 GLDH

SAH-hydrolase

NH3 + NADH + 2-Oxoglutarate Glutamate + NAD+ + H2O Giá trị tham chiếu của Hcy huyết tương: 5-15 µmol/L

* Kít thuốc thử của hãng DIALAB gồm 2 lọ chứa thành phần: - S-Adenosylmethionine (SAM) - NADH - TCEP - 2-Oxoglutarate - Glutamate dehydrogenase - SAH hydrolase - Adenosine deaminase - Hcy methyltransferase * Chuẩn Hcy: gồm 5 mức: - Mức 1: nồng độ 2,0 µmol/l - Mức 2: nồng độ 6,7 µmol/l - Mức 3: nồng độ 15,0 µmol/l - Mức 4: nồng độ 27,6 µmol/l - Mức 5: nồng độ 51,5 µmol/l * Huyết thanh kiểm tra: gồm 3 mức:

- Mức 1: giá trị trung bình là 7,29 µmol/l. - Mức 2: giá trị trung bình là 12,6 µmol/l. - Mức 3: giá trị trung bình là 25,0 µmol/l.

Tiến hành:

+ Cài đặt các thông số xét nghiệm, các giá trị của calibrator, huyết thanh kiểm tra (quality control) theo tờ hướng dẫn của nhà sản xuất trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động AU480.

+ Chuẩn máy và chạy huyết thanh kiểm tra.

+ Bệnh phẩm: bệnh nhân nhịn đói qua đêm ít nhất 12h, lấy máu tĩnh mạch cho vào chống đông Heparin, để 30 phút trong môi trường lạnh (nhiệt độ 2 – 80C), sau đó lấy ra ly tâm và tách huyết tương cho vào tủ lạnh -200C. Khi đủ số

lượng mẫu sẽ cho chạy xét nghiệm Hcy trên hệ thống xét nghiệm AU 480 của Olympus.

Hình 2.1: Hệ thống máy AU 480 của hãng Beckman Coulter

2.8. Xử lý số liệu

Số liệu thu thập được xử lý bằng các thuật toán thống kê y học trên máy vi tính theo phần mềm Statta 10.

2.9. Đạo đức nghiên cứu

- Nghiên cứu không vi phạm các quy định về đạo đức trong nghiên cứu y học.

- Các thông tin, xét nghiệm liên quan đến bệnh nhân đều được giữ bí mật, chỉ để phục vụ nghiên cứu, khơng nhằm mục đích nào khác.

- Bệnh nhân có quyền từ chối tham gia nghiên cứu nếu nhận thấy có những yếu tố ảnh hưởng khơng có lợi cho bản thân theo ý kiến cá nhân.

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu

Bảng 3.1. Đặc điểm về tuổi Đối tƣợng Min