Quy trính tinh sạch sản phẩm PCR sƣ̉ du ̣ng kit QIAQUICK gel

CHƢƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.4. Quy trính tinh sạch sản phẩm PCR sƣ̉ du ̣ng kit QIAQUICK gel

Kit này đƣợc dùng để tinh sạch DNA có kìch thƣớc từ 70bp đến 10kb từ gel agarose dạng chuẩn hoặc dạng low-melt trong đệm TBE hoặc TAE. Với lƣợng agarose < 400mg có thể đƣợc tiến hành trên một cột.

Các bước tiến hành:

1. Cắt các mảnh gel agarose chứa DNA bằng con dao mảnh, sắc.

2. Đựng và cân mảnh gel vào trong ống khơng màu. Bổ sung 3 thể tìch đệm QG cho một thể tìch gel. Với agarose>2% thí bổ sung 6 thể tìch đệm QG.

3. Ủ ở 50 °C trong 10 phút. Để giúp hịa tan gel thí cứ 2-3 phút lại vortex mỗi ống trong thời gian ủ.

4. Sau khi gel đã hịa tan hồn tồn, kiểm tra nếu màu sắc của hỗn hợp có màu vàng là đƣợc (tƣơng tự nhƣ đệm QG khi chƣa hòa tan gel agarose).

5. Thêm một thể tìch isopropanol vào mẫu và Mix.

6. Đặt cột QIAquick spin vào ống 2ml collection (thuộc kit).

7. Gắn DNA lên màng. Cho mẫu vào cột và ly tâm trong 1 phút. Thể tìch lớn nhất của cột là 800 μl. Nếu >800 μl thí đổ lại dịch lên cột và ly tâm lại.

8. Đổ bỏ phần dịch chạy qua cột và đặt lại cột vào ống cũ.

9. Thêm 0,5 ml đệm QG vào cột và ly tâm 1 phút. Giúp loại bỏ tất cả agarose. 10. Rửa cột: bổ sung 0.75 ml đệm PE vào cột và ly tâm 1 phút.

11. Bỏ phần dịch qua cột và ly tâm cột thêm 1 phút ở 17.900g (13.000 rpm). 12. Đặt cột vào trong ống 1,5 ml sạch.

13. Thôi DNA: Thêm 50 μl đệm EB hoặc nƣớc (pH 7.0 - 8.5) vào trung tâm màng và ly tâm 1 phút. Để tăng nồng.

14. Cột 1 phút rồi ly tâm trong 1 phút.

15. Kiểm tra sản phẩm tinh sạch bằng điện di trên gel acrylamide hoặc agarose 2.2.5. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose:

Dùng gel ở các nồng độ khác nhau có thể phân tách đƣợc các đoạn DNA có kìch thƣớc khác nhau (Bảng 10).

Bảng 10: Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tá ch acid Nucleic

Nồng độ gel (%w/v) Dãy kìch thƣớc tách hiệu quả (kb)

0,5 2 – 25 0,7 0,8 – 10 1,2 0,4 – 5 1,5 0,2 – 3 2,0 0,1 – 2 2,5 0,05 – 1,5

Sản phẩm PCR đƣợc trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol blue dạng vết) và nạp lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110 V trong khoảng 30 phút. Bản gel sau điện di đƣợc nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia tử ngoại (UV).

Ðiê ̣n di trên gel polyacrylamide:

Hiệu quả của sự phân tách DNA trong gel phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide (Bảng 11), kìch thƣớc và điện tìch của DNA.

Bảng 11: Sự phân tách DNA trong gel polyacrylamide khơng biến tính

Acrylamide (%w/v) Hiệu quả phân tách (nucleotide)

3,5 1000  2000 5 80  500 8 60  400 12 40  200 15 25  150 20 6  100

Các sản phẩm sau khi đƣợc điện di trên gel acrylamyde nồng độ thìch hợp sẽ đƣợc hiện băng với phƣơng pháp phù hợp có thể đƣợc nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia tử ngoại (UV) hoặc sử dung phƣơng pháp nhuộm bạc của Bassam (1991) và quan sát kết quả dƣới ánh sáng trắng.

2.2.6. Phƣơng pháp giải trính tự.

Phần lớn các phƣơng pháp nói trên đƣợc sử dụng để sàng lọc bƣớc đầu đột biến điểm/SNPs. Để khẳng định chình xác đột biến hay biển đổi ngƣời ta phải giải trính tự trực tiếp. Nguyên tắc của hầu hết các phƣơng pháp giải trính tự hiện nay đều dựa trên phƣơng pháp enzyme giải trính tự. Với sự phát triển của các enzyme ADN polymerase và các hợp chất hóa học, phƣơng pháp này cho phép sàng lọc SNPs hiệu quả rất cao. Để thực hiện đƣợc giải trính tự bằng máy tự động thí các mạch đơn DNA đƣợc tổng hợp trong ống phản ứng giải trính tự phải đƣợc đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser.

là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di Phần điệndi polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trƣớc nó.

Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trính điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thí vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ đƣợc con mắt cảm quang ghi nhận và lƣu lại thành một đỉnh cƣờng độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cƣờng độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tƣơng ứng với các màu để cuối cùng phân tìch thành trính tự của đoạn DNA Với các máy thế hệ mới sau này, ngƣời ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trính tự có thể thực hiện đƣợc chỉ trong một ống nghiệm. Phƣơng pháp này cho phép xác định chình xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất cao cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến nhƣ: loại đột biến, vị trì, hậu quả. Tuy nhiên nó có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền.

2.2.7. Tình tốn thống kê

Xƣ̉ lý các sớ liê ̣u phân tìch theo các phƣơng pháp thống kê thƣờng dùng . So sánh các đặc trƣng thống kê mẫu bằng phép ki ểm định thống kê 2 với mức ý nghĩa α = 0,05.

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC LÂM SÀNG CỦA CÁC BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRONG NGHIÊN CỨU THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRONG NGHIÊN CỨU

Mẫu mô của các bê ̣nh nhân ung thƣ đ ại trực tràng sử dụng trong nghiên cứu đƣơ ̣c thống kê với các đă ̣c điểm bê ̣nh ho ̣c lâm sàng trong Bảng 12.

Bảng 12: Thống kê mẫu tách chiết DNA củ a bê ̣nh nhân ung thƣ đa ̣i trƣ̣c tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng

Đặc điểm Số lƣợng Tỷ lệ % Tuổi ≤50 15 23,1 >50 50 76,9 Giới tình Nam 31 47,7 Nữ 34 52,3 Vị trì ung thƣ Đại tràng 31 47,7 Trực tràng 32 49,2 Đại trực tràng 2 3,1 Hạch 0 15 23,1 13 19 29,2 >3 31 47,7 Ổ sùi lt Có 30 46,2 Khơng 35 53,8 Loại mô bệnh học khối u

Ung thƣ biểu mô

Từ kết quả trong Bảng 12 cho thấy tính trạng mắc ung thƣ đại trực tràng tập trung nhiều hơn hẳn ở nhóm tuổi trên 50 (76,9%), 100% là ung thƣ biểu mô tuyến. Ung thƣ xảy ra tại trực tràng và đại tràng là tƣơng đối đồng đều với đa số các trƣờng hợp đều có hạch, số hạch tƣờng đối nhiều. Kìch thƣớc và số lƣợng hạch thay đổi theo từng bệnh nhân.

3.2. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MẪU MÔ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRỰC TRÀNG

Sử dụng kit tách chiết DNA QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN (Đức). 65 cặp mẫu mô (mẫu u và mẫu lân cận u) của 65 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đã đƣợc tách chiết thu DNA tổng số. Kết quả tách chiết DNA tổng số tƣ̀ các mẫu mô đƣợc minh họa trong (Hình 10).

Hình 10: Hình ảnh điện di DNA t ổng tách chiết từ mô bệnh nhân ung thư đại trực tràng (điện di trên gel agarose 0.8%, nhuộm ethidium bromide).

G1,3,5:DNA tổng số mẫu mô lân cận u G2,4,6 : DNA tổng số mẫu mô u

Theo Hình 10, các băng DNA tổng số tƣơng đối sáng, gọn chứng tỏ hàm

lƣợng DNA trong mẫu khá cao, ìt bị đứt gãy, đủ điều kiện để tiến hành các thì nghiệm tiếp theo. Do đó, chúng tơi sử dụng các mẫu DNA tổng số đã đƣợc tách chiết thành công để tiến hành các bƣớc nghiên cứu tiếp theo.

3.3. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN 4977 bp CỦA DNA TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR

Để nhận biết khả năng xẩy ra đột biến mất đoạn 4977 bp xảy ra trong hệ gen ty thể, chúng tôi đã áp dụng k ỹ thuật PCR sử dụng đồng thời 4 cặp mồi: mtDNA, 49771, 49772 và ND3 và các thành phần phản ứng nhƣ đã trính bày ở phần phƣơng pháp.

Sử dụng DNA tổng số đã đƣợc tách chiết từ mô của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng làm khuôn cho phản ƣ́ng PCR . Sử dụng các cặp mồi mtDNA, 4977-1, 4977-2 và ND3 cho lần lƣợt cho các cặp mẫu DNA tổng số đã thu đƣợc. Sản phẩm PCR đƣợc tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,7% và gel acrylamide 8% nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia UV ở bƣớc sóng 245nm, chúng tơi thu đƣợc các kết quả trong Hình 11, Hình 12. Kết quả cho thấy, sản phẩm PCR có kìch thƣớc tƣơng ứng với kìch thƣớc mong đợi. Với cặp mồi mtDNA cho ta sản phẩm tƣơng ứng dài 433 bp, Sản phẩm của cặp mồi 4977–2 cho băng có kìch thƣớc tƣơng ứng 381 bp và với cặp mồi ND3 cho sản phẩm có kìch thƣớc 246 bp. Nhƣ vậy, chúng tôi đã thành công trong việc sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen trong vùng trính tự bảo thủ của mtDNA, đoạn gen nằm trong vùng ND3 (chứa đoạn bị mất 4977 bp) của các bản sao mtDNA không bị đột biến mất đoạn và đoạn gen không chứa đoạn bị mất 4977 bp ứng với của các bản sao mtDNA bị mất đoạn .

Hình 11: Ảnh điện di kiểm tra các sản phẩm của phản ứng PCR ở cả mẫu u và lân cận u 1: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi mtDNA mô u 2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi

mtDNA mô lân cân u

3: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi

4977–2 mô u

4: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi

4977–2 mô lân cân u

5: Thang chuẩn 100bp fermentas

6: Thang chuẩn 250bp Biolab

7: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ND3

mô u

8:Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ND3

mô lân cân u

Hình 12: Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR có đối chứng âm

1: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi

mtDNA mẫu mô u

2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi

mtDNA mẫu mô lân cận u

3: Đối chứng () cặp mồi mtDNA

4: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–

2 mẫu mô u

5: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–

2 mẫu mô lân cận u

6: Đối chứng () cặp mồi 4977–2 7: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ND3 mô u 8: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ND3 mô lân cận u 9: Đối chứng () cặp mồi 10398

Hính ảnh điện di cho thấy băng sáng, rõ nét, không xuất hiện băng phụ với kìch thƣớc sản phẩm của phản ứng PCR nhƣ mong đợi. Mặt khác, ở trên cùng một đối tƣợng bệnh nhân mà cho cả sản phẩm PCR đột biến mất đoạn 4977-2 và cho cả sản phẩm ND3 chứng tỏ mtDNA có cả bản sao đột biến mất đoạn và cả bản sao không xuất hiện đột biến mất đoạn.

Hơn nữa, để kiểm tra chất lƣợng sản phẩm PCR thu đƣợc trƣớc khi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành làm đối chứng âm, sử dụng nƣớc tinh khiết thay cho DNA tổng số đối với cặp mồi mtDNA, 4977-2 và ND3. Kết quả trong Hình 12 cho thấy các giếng đối chứng âm không xuất hiện băng, chứng tỏ mẫu PCR không bị nhiễm DNA lạ. Sản phẩm PCR thu đƣợc có kìch thƣớc mong đợi, các băng sáng, rõ nét và không xuất hiện băng phụ chứng rỏ khơng có hiện tƣợng bắt cặp không đặc hiệu. Mặt khác, chúng ta nhận thấy đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA có thể xuất hiện ở cả mẫu mơ u và lân cận u hay chỉ xuất hiện ở mô u hoặc mô lân cận u mà không xuất hiện ở loại mơ cịn lại. Và cũng có trƣờng hợp đột biến không xẩy ra ở cả mô u và mơ lân cận u.

Hình 13: Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR trường hợp có đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA

Giếng 1: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô lân cân u Giếng 2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô u

 Giếng 1,2: Trƣờng hợp đột biến mất đoạn 4977-2 xuất hiện ở cả ở mô u và lân cận của cùng một bệnh nhân

Giếng 3: Đối chứng âm của cặp mồi 4977-2 Giếng 4: Thang chuẩn 100bp của fermentas

Giếng 5: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô lân cận u Giếng 6: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô u

 Giếng 5, 6: Trƣờng hợp đột biến mất đoạn 4977-2 chỉ xuất hiện ở mô lân cận u mà không xuất hiện ở mô u của cùng một bệnh nhân.

Giếng 7: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô lân cân u Giếng 8: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô u

 Giếng7, 8 : Trƣờng hợp đột biến mất đoạn 4977-2 chỉ xuất hiện ở mô u mà không xuất hiện ở mô lân cận u của cùng một bệnh nhân.

Kết quả điện di (Hình 13) đã cho thấy sản phẩm PCR thu đƣợc có kìch thƣớc mong đợi, các băng sáng, rõ nét, không xuất hiện băng phụ. Đột biến 4977-2 có thể xẩy ra với các mức độ biểu hiện khác nhau, có thể xuất hiện ở cả 2 loại mô (mô u và mô lân cận u) nhƣng cũng có thể chỉ xuất hiện ở mơ lân cận u nhƣ trƣờng hợp bệnh nhân ở giếng số 5, 6. Ngƣợc lại, có trƣờng hợp đột biến chỉ xuất hiện ở mô u (trƣờng hợp bệnh nhân ở giếng 7, 8).

3.4. KẾT QUẢ XỬ LÝ SẢN PHẨM PCR SỬ DỤNG CẶP MỒI 4977–2 BẰNG ENZYME GIỚI HẠN BẰNG ENZYME GIỚI HẠN

Theo những kết quả đã trính bày ở trên, chúng tôi đƣa ra nhận định: trong mtDNA của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng có chứa đột biến mất đoạn 4977 bp với các mức độ đột biến cao, thấp khác nhau tùy vào mẫu mô củ a tƣ̀ng bê ̣nh nhân . Tuy nhiên, để kiểm tra tình chình xác của sản phẩm PCR kìch thƣớc 381 bp (cặp

mồi 4977–2), chúng tôi tiến hành xử lý sản phẩm PCR với enzyme giới hạn HaeIII.

HaeIII là enzyme endonuclease nhận biết DNA tại trính tự:

Trong trƣờng hợp sản phẩm PCR thu đƣợc là chình xác sẽ chứa 2 vị trì nhận biết của HaeIII nên khi cắt sẽ tạo thành 3 đoạn có kìch thƣớc 141 bp, 183 bp và 57 bp. Sản phẩm của quá trính xử lý với enzyme cắt đƣợc điện di kiểm tra cùng với sản phẩm PCR trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium và quan sát dƣới tia UV bƣớc sóng 245 nm (Hình 14).

Hình 14: Ảnh kết quả xử lý sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 với enzyme giới hạn (điện di trên gel agarose 1,3%, nhuộm ethidium bromide).

Giếng 1: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 trƣớc khi cắt bằng HaeIII của mô lân cận u.

Giếng 2: Sản phẩm PCR đƣợc cắt bằng HaeIII của m ẫu mô lân cận u (giếng 3).

Giếng 3 : Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 trƣớc khi cắt bằng HaeIII mô u Giếng 4: Sản phẩm PCR đƣợc cắt bằng HaeIII của mẫu mô u.

Từ kết quả thu đƣợc trong Hình 14 chúng tơi nhận thấy: sản phẩm PCR

trƣớc khi cắt bằng HaeIII chỉ xuất hiện trên bản điện di 1 băng duy nhất kìch thƣớc 381 bp, sản phẩm PCR sau khi cắt bằng HaeIII trên bản điện di xuất hiện 3 băng kìch thƣớc 141, 183 bp, 57 bp. Tiến hành xử lý sản phẩm PCR (cặp mồi 4977–2) trên tất cả các mẫu có đột biến mất đoạn chúng tôi đều thu đƣợc các kết quả tƣơng tự nhau. Nhƣ vậy, sản phẩm 381 bp thu đƣợc nhờ kỹ thuật PCR một lần nữa lại đƣợc khẳng định, khơng có sự khuếch đại nhầm và đạt độ tin cậy để tiến hành các phân tìch tiếp theo.

3.5. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ SẢN PHẨM PCR CỦA ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN 4977 bp CỦA mtDNA ĐOẠN 4977 bp CỦA mtDNA

Sau khi cha ̣y PCR thu s ản phẩm đột biến mất đoạn 4977-2, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm bằng kìt tinh sạch DNA của QIAgen. Sản phẩm thu đƣợc kiểm tra trên gel polyacylamide 8%, nhuộm ethidium bromide. Sản phẩm đạt độ tinh sạch mong muốn đƣợc gửi đi giải trính tự.

(Đọc kết quả giải trính tự dựa trên phần mềm Sequence scanner

V1.0) (So sách trính tự bằng phần mềm bioedit)

Trính tự thu đƣợc từ việc giải trính tự đƣợc so sánh với trính tự mtDNA trên cơ sở dữ liệu NCBI. Trên hính cho thấy:

 Đoạn DNA bi ̣ mất nằm giƣ̃a vi ̣ trì 8470 và 13446

Hình 15: Phần mềm đọc kết quả giải trình tự bioedit so sánh trình tự