2.3.1. Phƣơng phân tích xác định các thơng số chất lƣợng nƣớc thải 2.3.1.1. Xác định pH 2.3.1.1. Xác định pH
pH đƣợc xác định trên máy Hanna HI 2550. Trƣớc khi đo pH trên mẫu, tiến
hành hiệu chuẩn đầu điện cựcbằng các dung dịch đệm hiệu chuẩn, trƣớc mỗi lần thực hiện cần vệ sinh đầu điện cực và đầu dò nhiệt độ bằng nƣớc cất hoặc nƣớc đã loại ion[23].
2.3.1.2. Xác định COD
Hút 2ml mẫu (pha lỗng nếu cần) vào bình phản ứng, thêm 1 ml K2Cr2O7và thêm 3 ml dung dịch H2SO4 - Ag2SO4, đậy kín và lắc đều.
Phá mẫu ở 150oC trong 2 giờ. Mẫu sau khi phá, để nguội, thêm 1- 2 giọt chỉ
thị Feroin và tiến hành chuẩn độ lƣợng dƣ dicromat trong mẫu bằng muối Mohr ((NH4)2Fe(SO4)2.6H2O) nồng độ 0,12 mol/l.
Dừng việc chuẩn mẫu khi thấy dung dịch chuyển từ màu xanh lá sang màu
đỏ gạch. Ghi lại thể tích muối Mohr tiêu tốn.
Mẫu trắng: sử dụng nƣớc cất. Tiến hành tƣơng tự nhƣ trên
Xác định COD bằng công thức:
COD = 8000c.(V1−V2)V0
Trong đó:
COD: nhu cầu oxi hóa học, mg/l;
c là nồng độ của sắt (II) amoni sunfat, mol/l; V0 là thể tích của phần mẫu thử, ml;
V1 là thể tích sắt (II) amoni sunfat sử dụng khi chuẩn độ mẫu trắng, ml; V2 là thể tích sắt (II) amoni sunfat sử dụng khi chuẩn độ mẫu thử, ml; 8000 là khối lƣợng mol của ½ O2, tính bằng mg/l [22].
2.3.1.3. Hàm lƣợng các chất rắn lơ lửng
Sấy giấy lọc ở 105oC, trong 1 giờ, cân và ghi khối lƣợng cân của giấy lọc sau
khi sấy.
Để mẫu đạt nhiệt độ phòng, lắc đều để đồng nhất mẫu.
Sau khi mẫu đã đồng nhất, lấy 20 ml mẫu lọc qua giấy lọc, tráng ống đong bằng 20 ml nƣớc cất và dùng lƣợng nƣớc này để rửa giấy lọc.
Sấy giấy lọc sau khi lọc ở 105oC ± 2oC từ 1 giờ đến 2 giờ. Cân và ghi lại
khối lƣợng giấy lọc
Hàm lƣợng chất rắn lơ lửng (TSS), tính theo cơng thức:
V a b p 1000( ) Trong đó: p (TSS): hàm lƣợng chất rắn lơ lửng, mg/l; b:khối lƣợng giấy lọc sau khi lọc, mg; a: khối lƣợng giấy lọc trƣớc khi lọc, mg; V: thể tích mẫu, ml[24].
2.3.1.4. Chỉ số thể tích bùn
Mẫu cho vào ống đong 1 lít, để lắng 30 phút, ghi thể tích bùn cịn lại (V ml).
Sau đó lấy 1 lít nƣớc đó đi xác định TSS và đƣợc tính nhƣ sau:
𝑆𝑉𝐼 =𝑉. 1000 𝑇𝑆𝑆
Trong đó:
SVI: Chỉ số thể tích bùn, ml/g;
V: Thể tích chất rắn lắng sau 30 phút trong ống đong 1 lít; TSS: Hàm lƣợng chất rắn của mẫu, mg/l;
1000: Hệ số quy đổi miligam ra gam[32].
SVI trong khoảng 80 – 120 ml/g là tốt nhất[36].
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập các chủng vi khuẩn
Từ các mẫu nƣớc thải, lấy 50ml cho vào bình tam giác 250ml chứa 50ml môi
Xử lý mẫu trên ở 80oC trong 20 phút, sau đó để mẫu về nhiệt độ phòng và tiến hành pha loãng mẫu bằng cách: Hút 1ml mẫu cho vào 9ml mơi trƣờng pha
lỗng NaCl 0,85% đƣợc dung dịch mẫu ở độ pha loãng 10-1, tiến hành tƣơng tự để
thu đƣợc các độ pha loãng tiếp theo, pha loãng đến 10-4[21].
Lấy 0,1 ml mẫu ở các độ pha lỗng trên cấy chang lên mơi trƣờng chọn lọc
Hans[20], mỗi độ pha lỗng lặp lại 2 lần, sau đó ni ủ các mẫu ở 35oC trong 48
giờ. Sau thời gian nuôi ủ, chọn, nhận dạng các chủng riêng biệt, cấy ria trên môi trƣờng Hans đến khi thu đƣợc chủng thuần khiết[20].
Nhận diện, phân loại sơ bộ các loài vi khuẩn qua đặc điểm hình thái [5].
2.3.3. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase
Tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm,
đục lỗ thạch [30] và xác định hoạt lực enzyme[34].
Phƣơng pháp cấy chấm điểm: Cấy chấm điểm các chủng trên môi trƣờng
Hans nuôi ở 35oC trong 48 giờ.Sau thời gian nuôi, để đĩa Petri vào tủ lạnh trong 12
giờ. Sau đó cho vào tủ ấm 40oC trong 6 giờ. Lấy ra, cho vào mỗi đĩa Petri 5 ml
thuốc thử lugol, dàn đều khắp mặt thạch; để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết thuốc thử và đo kích thƣớc vịng phân giải[20].Tính tỷ số giữa đƣờng kính vịng phân giải (D1) và đƣờng kính khuẩn lạc (d1).
Phƣơng pháp đục lỗ thạch: Các chủng đƣợc chọn tăng sinh trên môi trƣờng
lỏng NB bổ sung thêm cellulose 1%, nuôi 48 giờ ở 35oC. Sau thời gian ni, đem ly
tâm với tốc độ 10.000 vịng/phút trong 15 phút, thu dịch trong phía trên. Hút 100µl dịch trong thu đƣợc sau ly tâm của mỗi chủng cho vào từng giếng (đƣờng kính giếng d2 = 8mm) trên mơi trƣờng thử hoạt tính cellulase ngoại bào. Ni các đĩa thạch này ở 35oC trong vòng 48h. Sau đó tiến hành nhuộm lugol và tính hiệu số giữa vịng phân giải D2 và đƣờng kính giếng d2.
Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzymecellulase: Xác định dựa vào lƣợng đƣờng khử tạo thành sau phản ứng bằng phƣơng pháp đo quang phổ theo Miller[34]:
- Cơ chất đƣợc chuẩn bị bằng cách: cân chính xác 0,1 g cellulose, hòa tan cùng với nƣớc,định mức 100ml và lắc đều. Sau đó hút 150μl cellulose và 150 μl
dịch enzymemẫu cho vào ống eppendorf, lắc đều và ổn nhiệt ở 50oC trong 10 phút,
bổ sung thêm 600 μl DNS, để trong nƣớc đang sôi nhiệt độ 95-100oC trong vòng 5
phút. Mẫu kiểm chứng chuẩn bị tƣơng tự nhƣ trên, tuy nhiênenzyme sẽ bị bất hoạt
bằng cách cho luôn hỗn hợp cellulose và enzymevào nƣớc ở 95-100oC. Làm nguội
các mẫu bằng nƣớc lạnh và xác định giá trị OD540nm. Dựa vào đƣờng chuẩn để tính lƣợng đƣờng C có trong mẫu. Hoạt độ enzyme đƣợc xác định theo công thức:
E= C.1000.V.f180.V'.t
Trong đó:
C là nồng độ đƣờng tƣơng ứng mà enzyme phân cắt, mg/ml V là tổng thế tích enzyme và cơ chất tham gia phản ứng, ml V’ là thể tích dịch enzyme tham gia phản ứng, ml
f là hệ số pha loãng
t là thời gian phản ứng của cơ chất và enzyme, phút 180 là khối lƣợng mol của glucose, g/mol.
- Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng bằng cách : Cân chính xác 0,1 g glucose ịa tan bằng nƣớc cất và định mức 100ml. Pha loãng dung dịch glucose bằng nƣớc cất để nồng độ đạt đƣợc là 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml. Hút 300 μL glucose ứng với mỗi nồng độ glucose trên và thêm vào lần lƣợt các ống eppendorf 600 μL. Lắc đều để đảm bảo glucose phản ứng hồn tồn với
DNS. Để trong nƣớc sơi với nhiệt độ 95-100oC trong vòng 5 phút. Làm nguội các
mẫu bằng nƣớc lạnh và xác định giá trị OD540nm.