- Cột trắng là hàm lượng đồng phân 2,3,7,8TCDD
U. bacterium clone TfdAx65-II bacterium clone U18 TfdA
3.2.3. Sự tồn tại của gene dioxin dioxygenase ở chủng BHNB
Hai q trình oxy hóa DD, DBF và các hợp chất tương tự bởi vi khuẩn hiếu khí có sự tham gia của enzyme dioxin dioxygenase và được nghiên cứu nhiều nhất đó là gắn hai oxy ở vị trí bên 1,2 và đơi khi ở các vị trí 2,3 hoặc 3,4 của một nhân thơm và chuyển hóa DD, DF sang dạng cis-dihydrodiol và gắn hai oxy ở vị trí góc 4 và 4a của nhâm thơm liền kề cầu nối ether và các sản phẩm trung gian đi tiếp vào chu trình Krebs. Con đường thứ 2 được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm hơn cả và chủng vi khuẩn S. wittchii RW1 là đối tượng được nghiên cứu chi tiết nhất [36, 93]. Ngoài ra các gene tham gia mã hóa DBF angular dioxygenase cũng được nghiên cứu nhiều ở vi khuẩn thuộc các chi Terrabacter, Janibacter, loài P. resinovorans, P.
stutzezi. Các gene này gồm dbtfA12 mã hóa DF 4,4a dioxygenase và dbfA3 và dbfA4 mã hóa dioxygenase tham gia vào hệ thống vận chuyển điện tử [58], carAc
mã hóa carbazol 1,9a-dioxygenase.
Cặp mồi DIOXY-F và DIOXY-R được thiết kế dựa trên trình tự của một số gene mã hóa tiểu đơn vị α của enzyme dioxin dioxygenase. Theo tính tốn lý thuyết đoạn gene mã hóa tiểu đơn vị α-dioxygenase nhân được sẽ có kích thước khoảng 600-700 bp. Kết quả ở hình 13 cho thấy sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa dioxygenase từ DNA tổng số của chủng BHNB1 có kích thước như tính tốn lý thuyết. Nghiên cứu khác sử dụng cặp mồi DIOXY-F và DIOXY-R cho thấy sự tồn tại của đoạn gene mã hóa dioxygenase trong chủng vi khuẩn BU3 sử dụng dioxin [4] và các vi khuẩn sử dụng DBF như Terrabacter sp. DMA và Rhodococcus sp. HDN3 [12,14].
Hình 3.17: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene dioxin dioxygenase với cặp mồi DIOXY- F và DIOXY-R với thang đo M là 1kb
BHNB1 M
Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa dioxin dioxygenase từ chủng BHNB1 được làm sạch và xác định trình tự. So sánh trình tự đoạn gene nhân lên từ chủng BHNB1 cho thấy sản phẩm PCR nhân được có mức tương đồng cao nhất chỉ 76% với trình tự dịng PCR vi khuẩn không nuôi cấy phân hủy benzen (74/97
nucleotid so sánh) và 71% với trình tự dịng PCR của chủng S. sp. HPC1224
(310/438 nucleotide so sánh). Từ cây phát sinh chủng loại (hình 3.18) cho thấy gene
dioxygenase của chủng BHNB1 là gần gũi nhất với gene của chủng S. sp.
HPC1224. Bên cạnh đó trình tự gene của chủng BHNB1 có mức tương đồng với gene tương tự của các chủng E. coli TW 14359, 87-14, TB12A, 86-24, 493/89 với
mức độ tương đồng 70%. Tương đồng 71% với các chủng Citrobacter sp.
HPC1216, C. freundii HPC 1276, C. sp. HPC 784 và chủng S.sp. HPC 565. Tuy
nhiên, trình tự dịng PCR chủng vi khuẩn khơng ni cấy phân hủy benzen là ngắn và trong nghiên cứu này đoạn gene từ chủng BHNB1 mới chỉ được xác định một phần. Do vậy, các kết quả bổ sung về phân loại và gene mã hóa dioxin dioxygenase là rất cần thiết để khẳng định chính xác mối quan hệ giữa các chủng vi khuẩn này.
Các nghiên cứu trước đây cho thấy đoạn gene nhân lên từ các chủng sử dụng DBF Terrabacter sp. DMA và Rhodococcus sp. HDN3 sử dụng cặp mồi DIOXY-F và
DIOXY-R đều có quan hệ gần với gene dbfA1[15,17]. Kết quả trong nghiên cứu này
một lần nữa khẳng định sự đa dạng gene mã hóa dioxygenase trong các chủng vi khuẩn sử dụng DBF.
Hình 3.18: Cây phát sinh chủng loại gene dioxin dioxygenase của chủng BHNB1.Thước đo thể hiện sự sai khác 5 nucleotide trên 100 nucleotide so sánh
Từ cây phát sinh chủng loại cho ta thấy gene dioxin dioxygenase nằm ở một
nhánh riêng và có quan hệ gần gũi nhất với chủng Stenotrophomonas sp. HPC122
và các vi khuẩn không thông qua ni cấy đặc biệt là có sự tương đồng với vi khuẩn không qua nuôi cấy chứa gene giả định benzen dioxygenase. Quan hệ xa hơn nữa với các chủng Escherichia coli và Citrobacter.
Trong nghiên cứu của S. Selvakumaran và cộng sự (2011) chỉ ra 30 chủng vi
khuẩn C.spp. được phân lập từ đất có khả năng phân hủy các hợp chất vòng như:
phenol, benzoate, acid benzoic và sự chuyển khối của mono-chlorophenols và di-
chlorophenol trong khoảng từ 24 đến 48h ủ ở 30o
C. Mức độ tương đồng trình tự gene và cây phát sinh bản dịch của gene ARHD (với kích thước 730 nucleoitde) đã mơ tả sự đa dạng của 9 chủng Citobacter bao gồm: HPC 255, HPC 369, HPC 560, HPC570, HPC784, HPC1196, HPC1276 và HPC1299.
Escherichia coli strain TW14359 phenylpropionate dioxygenase E.coli strain 87-14 phenylpropionate dioxygenase|
E. coli strain 86-24 phenylpropionate dioxygenase| E. coli strain TB182A phenylpropionate dioxygenase E. coli strain 493/89 phenylpropionate dioxygenase
Stenotrophomonas sp.HPC1224
Un.bacteriumBEDm-I-5-35 Un.bacterium BEDm-I-5-9 Un. bacterium BEDm-I-0-49
Acinetobacter sp. BHNB1 Citrobacter sp. HPC 1216 | C. freundii strain HPC 1276 | C. sp. HPC 784 | Stenotrophomonas sp. HPC565 C. freundii strain HPC 255 C. sp. HPC369 | C. sp. HPC 560 C. sp. HPC 570
Un.bacteriumfor putative benzene dioxygenase
|
Vinita Verma và đtg (2010) nghiên cứu đất bị ô nhiễm với các sản phẩm dầu mỏ. Đã chứng minh sự đa dạng gene của 30 chủng Stenotrophomonas được phân lập bằng phân tích đọc trình tự nucleotide và đa dạng phát sinh loài 16S rRNA. Đa dạng gene chức năng được phân tích dựa vào khả năng phân hủy phenol, cresol, catechol, 4- methylcatechol và hydroquinol. Dựa trên sự đa dạng chức năng, đa dạng gene và môi trường sự cộng sinh các lồi vi khuẩn đã biết có thể được kỳ vọng cho chương trình phân hủy sinh học của các chủng vi khuẩn này.
Trong khi đó theo nghiên cứu của các nhà khoa học Malayxia, AAA Hamid và đtg (2010) cũng đã so sánh trình tự gene của chủng vi khuẩn không nuôi cấy AAZ2 được phân lập từ đất có nguồn gốc núi lửa thì chủng này có mức tương đồng
cao với chủng C. sp. strain JC73 và có khả năng sử dụng 2,2-dichloropropionate
(2,2-DCP) như là nguồn carbon. Chủng này đã được chứng minh là có khả năng trong việc phân hủy các hợp chất có clo bằng việc sinh ra enzyme dehalogenase.
Cũng nghiên cứu về chủng vi khuẩn C. sp. Farshid Kafilzadeh và đtg (2012) đã chỉ ra một số chủng vi khuẩn phân lập từ đất tại các bãi chơn lấp chất thải rắn sinh hoạt có 2,5-dichlorobenzoic acid (2,5-DCBA), kết quả là một số chủng vi khuẩn như
Citrobacter, Nisseria, Corynebactrium, sau 50 ngày ủ với 2,5-DCBA có hiện tượng
phân hủy bằng việc dung dịch chuyển sang màu đỏ.
Như vậy có thể nói rằng việc nghiên cứu chủng Acinetobacter có khả năng
phân hủy các hợp chất vòng thơm đã được chỉ ra và việc phân tích xác định sự tồn tại của gene dioxin dioxygenase trong các chủng này cũng đã được xác nhận. Nhưng chưa có nghiên cứu nào chỉ ra sự phân hủy các hợp chất vịng thơm nói chung và dioxin cụ thể là 2,3,7,8-TCDD từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin đối với Acinetobacter này. Nghiên cứu trình bày dưới đây sẽ cung cấp cho ta về khả năng của chủng BHNB1 và BHNA1 trong việc phân hủy 2,3,7,8-TCDD.