CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
Mẫu Cây cơm rƣợu đƣợc thu hái tại rừng Cúc Phƣơng, thuộc tỉnh Ninh Bình, Việt Nam vào tháng 5 năm 2011. Tên cây đƣợc xác định bởi nhà thực vật học Ngô Văn Trại- Viện Dƣợc liệu. Mẫu tiêu bản số C-451 đƣợc lƣu tại Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu lấy về đƣợc rửa sạch, loại bỏ lá hƣ hỏng, phơi đến khô trong râm, sấy ở nhiệt độ 400C đến giòn, nghiền nhỏ thành dạng bột, bảo quản nơi khô ráo.
Cành và lá cây phơi khô , nghiền nhỏ đƣợc ngâm chiết vớ i metanol ở nhiệt độ phòng. Và chiết lần lƣợt bằng các dung môi n – hexan, chloroform, etyl axetat và butanol cho các cặn chiết tƣơng ứng.
Các dung môi dùng để chiết tách và chạy sắc ký là dung môi công nghiệp đƣợc làm khan, lọc và cất lại trƣớc khi sử dụng.
2.1.1. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết
Các phƣơng pháp sắc ký đƣợc sử dụng để nhận biết và phân lập các hợp chất từ cặn chiết thô bao gồm: sắc ký bản mỏng TLC, sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel pha thƣờng (Merck loại 40-63 m) hoặc pha đảo (ODS, YMC (30-50
μm)). Bên cạnh đó cịn dùng phƣơng pháp kết tinh để thu chất sạch.
2.1.2. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ra đƣợc xác định bằng cách kết hợp các phƣơng pháp vật lý và hóa học, sử dụng các phƣơng pháp phổ nhƣ: phổ khối lƣợng (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D, 2D-NMR).
2.1.3.1. Xác định điểm chảy:
Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy Boetius.
2.1.2.2. Phổ khối lƣợng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS)
Phổ khối ion hóa bụi điện tử ESI-MS đƣợc ghi trên máy ghi Agilent 6310 Ion Trap, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS đƣợc đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS.
2.1.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều đƣợc ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz với TMS là chất chuẩn nội.
2.1.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học: 2.1.3.1. Phƣơng pháp thử hoạt tính tim ma ̣ch: 2.1.3.1. Phƣơng pháp thử hoạt tính tim ma ̣ch:
Contraction là p hép thử đƣợc dùng trong sàng lọc các hoạt chất điều trị tim mạch, đƣợc đánh giá khá đắt tiền và hiện đại. Phép thử trên kênh Ca2+
và phép thử chống co thắt. Phƣơng pháp cho kết quả giá trị % độ giảm (% decrease), dùng để đánh giá khả năng điều trị bệnh tim.
2.1.3.2. Phép thử sàng lọc, phát hiện hoạt chất chống ung thƣ:
Các phép thử sàng lọc, phát hiện hoạt chất chống ung thƣ thực hiện trong đề tài này bao gồm: phép thử xác định độc tính với các dịng tế bào ung thƣ và phép thử trên cơ sở đích phân tử (Wnt/b-catenin signalling pathway).