vi khuẩn Gram dƣơng do có lớp peptidoglycan dày, các lỗ peptidoglycan co lại nên vẫn giữ màu tím Violet và không bị bắt màu của thuốc nhuộm Fuchsin. Khi rửa cồn nên rửa nhanh để đủ tẩy lớp lipid, lớp peptidoglycan bên trong sẽ bắt màu đỏ hồng ở lần nhuộm tiếp. Nếu dùng cồn quá lâu thì nó sẽ không bắt màu F uchsin ở lần sau (do lỗ peptidoglican đã bi ̣ cồn làm co la ̣i).
Hình 3.3. Tế bào của chủng vi khuẩn Vibrio T11 sau khi nhuộm Gram
(Tế bào vi khuẩn có hình dấu phẩy, bắt màu hồng của Fuschin)
3.3. Một số đặc tính sinh hóa của Vibrio
a. Khả năng chịu muối của các chủng Vibrio
Từ các chủng chọn lọc ta kiểm tra khả năng chịu muối của các chủng (Bảng 3.2)
Bảng 3.2. Khả năng chịu muối của các chủng Vibrio
Chủng
NaCl (%) 0 − − − − 3 + + + + 6 + + + + 8 + + − + 10 − − − −
Các chủng Vibrio nuôi trong môi trƣờng chứa trypton và muối NaCl ở các nồng độ khác nhau 0%, 3%, 6%, 8%, 10% ở pH 7,2 ± 0,2 nhiệt độ 37oC. Khả năng sống (làm đục môi trƣờng và tạo váng) đƣợc quan sát sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ nuôi cấy. Kết quả từ Bảng 3.2 cho thấy tất cả các chủng không sống đƣợc trong môi trƣờng không có NaCl nên ở các khu vực nƣớc ngọt (sông, hồ) vi khuẩn không sinh trƣởng, phát triển và nhu cầu của chúng đối với Na+
là bắt buộc. Kết quả này cũng giúp loại bỏ đƣợc loài V. mimicus và P. shigelloides vì theo Bảng 1.3 thì 2 loài vi khuẩn này có thể sống ở môi trƣờng không có NaCl.
Nồng độ muối các chủng vi khuẩn này sinh trƣởng nằm trong khoảng 3-8%, có chủng không mọc ở nồng độ 8% nhƣ chủng là T16. Các chủng phát triển mạnh nhất ở nồng độ 3%, gây đục môi trƣờng, chứng tỏ nhóm vi khuẩn này sống tốt ở ngoài vùng biển có độ mặn không quá cao. Vì các chủng vi khuẩn sống đƣợc ở các nồng độ muối nhƣ trên, nên hải sản nhƣ: tôm, cua và cá biển là các đối tƣợng chính để phân lập vi khuẩn này. Ở nồng độ muối 6%, các chủng phát triển nhƣng gây đục ít hơn 3% chứng tỏ đây chỉ là vùng lân cận, gần nhƣ là giới hạn trên đối với khả năng chịu muối của chúng. Ở 10% không có chủng vi khuẩn nào phát triển bởi nồng độ muối quá cao. Do đó, dịch bệnh do vi khuẩn này gây ra thƣờng bùng phát ở những vùng ven biển, nơi có lƣợng tiêu thụ hải sản cao.
Vì vậy ở các nghiên cứu tiếp theo, các môi trƣờng đều đƣợc bổ sung 3% muối vào.
Các chủng phân lập đƣợc nuôi trong ống nghiệm chứa môi trƣờng để lên men một trong các loại đƣờng nhƣ mannitol, sucrose, lactose, arabinose ở pH 7,4 và nhiệt độ 37o
C. Kết quả quan sát sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ cho thấy các chủng đều lên men đƣờng arabinose, mannitol và không lên men đƣờng lactose, sucrose. Kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 3.4 và Bảng 3.3.
Hình 3.4. Thí nghiệm lên men đƣờng của chủng vi khuẩn T5 (1-mannitol, 2- sucrose, 3-lactose, 4-arabinose, 5- đối chứng âm)
Bảng 3.3. Khả năng lên men đƣờng của các chủng vi khuẩn Vibrio
Chủng Loại đƣờng T5 T11 T16 T20 Mannitol + + + + Sucrose _ _ _ _ Lactose _ _ _ _ Arabinose + + + +
Đối với đƣờng mannitol, arabinose khả năng lên men của các chủng phân tích là khác nhau, biểu thị qua màu sắc môi trƣờng sau lên men. Kết quả cho thấy màu sắc trong môi trƣờng sau lên men là khác nhau, ở chủng T5 làm canh trƣờng manitol chuyển sang màu cam đục và canh trƣờng arabinose có màu cam trong. Có sự khác nhau nhƣ vậy là do các sản phẩm (rƣợu, các acid hữu cơ, CO2) sinh ra trong
quá trình lên men khác nhau về hàm lƣợng, tốc độ, làm pH môi trƣờng cũng khác nhau nên chúng làm thay đổi màu chỉ thị cũng khác nhau. Đối với hai loại đƣờng còn lại là lactose và sucrose, do không có enzyme phân giải nên kết quả lên men là âm tính vì vậy môi trƣờng vẫn giữ nguyên màu đỏ ban đầu của môi trƣờng lên men. Do vậy khả năng lên men đƣợc đánh giá bằng sự làm giảm pH của môi trƣờng dẫn đến sự thay đổi màu sắc của chỉ thị pH trong môi trƣờng.
Kết quả lên men đƣờng đã cho thấy cả 4 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc đều mang các đặc điểm hóa sinh đặc trƣng cho V. parahaemolyticus. Vì trong các
nghiên cứu trƣớc đó cho thấy V. mimicus, V. vulnificus và P. shigelloides không lên men đƣờng arabinose (Bảng 1.3), nhƣng trong nghiên cứu của chúng tôi cả 4 chủng đều lên men đƣờng arabinose.
c. Khả năng sử dụng lysin của các chủng Vibrio
Các chủng vi khuẩn Vibrio nuôi ở 37oC trong môi trƣờng cơ bản chứa lysin. Khả năng sử dụng lysin đƣợc đánh giá qua sự đổi màu của môi trƣờng nuôi. Nếu các chủng vi khuẩn có sản sinh enzyme carboxylase thì enzyme này sẽ xúc tác cắt bỏ nhóm carboxyl (-COOH) ở các acid amin, phóng thích CO2, tạo ra các sản phẩm có tính acid nhƣ amin hoặc diamin làm thay đổi màu môi trƣờng chứa chỉ thị phenol đỏ. Sau thời gian nuôi cấy là 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ kết quả quan sát từ Hình 3.5 và Bảng 3.4 cho thấy có sự đổi màu môi trƣờng nuôi đối với tất cả các chủng.