CHƢƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.2. Phƣơng pháp nhân bản PCR
Phản ứng PCR-ISSR: Phản ứng nhân gen đƣợc thực hiện trên máy PCR system 9700, trong thể tích là 25µl với các thành phần: 1X dung dịch đệm PCR, 2,5 mM
MgCl2, 2mM dNTPs, 100nM mồi, 50ng DNA khuôn và 0,5 đơn vị Taq polymerase.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp sau là 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bƣớc: biến tính 94oC trong 1 phút, gắn mồi 45 - 50oC (tùy từng mồi) trong 1 phút, kéo dài mồi 72oC trong 1 phút và kết thúc phản ứng ở 72o
C trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4oC. Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR sẽ đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% cùng với thang DNA chuẩn 1 kb. Gel agarose đƣợc nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dƣới tia UV.
Phản ứng PCR-SSR: Phản ứng nhân gen đƣợc thực hiện trong thể tích 25µl
gồm các thành phần: 1X dung dịch đệm PCR, 2,5 mM MgCl2, 2mM dNTPs, 100nM mỗi mồi xuôi và ngƣợc, 50 ng DNA khuôn và 0,5 đơn vị Taq polymerase. Các phản ứng đƣợc thực hiện trên máy PCR system 9700 với chu trình nhiệt: biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp sau là 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bƣớc: biến tính 94o
C trong 1 phút, gắn mồi 50 - 55oC (tùy từng mồi) trong 1 phút, kéo dài mồi 72o
C trong 1 phút và kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4oC. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 5% cùng với thang marker DNA chuẩn 100 bp sau đó nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dƣới tia UV.