Các giai đoạn Nhiệt độ (ºC) Thời gian (giây) Số chu kì
Biến tính ban đầu 96 60 1
Biến tính 96 10
25
Gắn mồi 50 5
Kéo dài 60 240
Giữ mẫu 4 Đến khi lấy mẫu 1
Tinh sạch sản phẩm để xác định trình tự
Sản phẩm của phản ứng xác định trình tự được tinh sạch bằng phương pháp cột sephadex theo hướng dẫn của nhà sản xuất theo qui trình sau:
Bước 1: Cho cột sephadex vào ống thu dịch ly tâm 2 ml và ly tâm 3.000
vòng/phút trong 2 phút.
Bước 2: Chuyển cột sephadex sang ống eppendorf 1,5 ml.
Bước 3: Chuyển toàn bộ dung dịch của phản ứng giải trình tự của mỗi mẫu
vào một cột sephadex và ly tâm 3.000 vòng/phút trong 2 phút.
Bước 4: Bỏ cột sephadex. Sấy khơ dung dịch của phản ứng giải trình tự trong
ống eppendorf bằng máy ly tâm chân khơng tại 1.500 vịng/phút trong 10 phút ở 45 o
C.
Sản phẩm sau tinh sạch được đọc kết quả trên máy phân tích trình tự tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer.
2.4.3. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của EPN
Sinh trưởng và phát triển của tuyến trong trùng trong vật chủ ấu trùng BSL:
được tiến hành dựa trên phương pháp đã được mô tả bởi Cabanillas & Rraulston (1994) và Elawad et al. (1999)]. Một ấu trùng BSL, cùng với 60 ấu trùng cảm nhiễm của mỗi chủng tuyến trùng được cho vào từng đĩa petri (3.5 cm x 1.5 cm) có lót giấy lọc ẩm. Giữ ẩm cho các đĩa petri và đặt chúng trong tủ định ôn ở nhiệt độ 27oC. Sau khoảng thời gian 12h từ 1 – 10 ngày tùy từng chủng tuyến trùng, ấu trùng BSL chết sẽ được lấy ra để mổ và kiểm tra trực tiếp dưới kính hiển vi soi nổi. Các giai đoạn phát triển của tuyến trùng được xác định dựa vào các đặc điểm đã được
mơt tả. Thí nghiệm tiến hành cho đến khi ấu trùng cảm nhiễm mới xuất hiện trên bề mặt ấu trùng BSL chết.
Sinh sản của tuyến trùng: dựa trên phương pháp đã được mô tả bởi Cabanillas
& Rraulston (1994) và Elawad et al. (1999) :Thí nghiệm tiến hành trên 10 công thức ở 10 nồng độ ấu trùng cảm nhiễm khác nhau theo mật độ từ 10 đến 100 IJs/ ấu trùng BSL. Mỗi công thức gây nhiễm trên 15 ấu trùng BSL. Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sau khi gây nhiễm đặt các đĩa petri vào tủ định ôn ở nhiệt độ 27 oC. Theo dõi số ấu trùng BSL chết sau 48h. Mỗi ấu trùng BSL chết được đặt vào White trap trong thời gian từ 2 - 10 ngày tùy từng chủng. Ấu trùng cảm nhiễm mới xuất hiện được thu mỗi ngày cho đến khi số lượng giảm đến hết. Ấu trùng cảm nhiễm được rửa sạch và đếm số lượng trực tiếp dưới kính hiển vi soi nổi [6].
2.4.4. Phƣơng pháp xác định độc lực của EPN
Thí nghiệm xác định độc lực của một chủng tuyến trùng được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Cabanillas & Rraulston (1994) với 12 công thức ấu trùng cảm nhiễm khác nhau: 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60,70, 80, 90, 100 IJs. Mỗi công thức gồm 15 ấu trùng BSL, thí nghiệm nhắc lại 3 lần.
Thí nghiệm được theo dõi trong 48h ở nhiệt độ 27 oC. Sau đó, thống kê số lượng sâu chết do tuyến trùng. Các sâu bị chết do tuyến trùng chỉ được xác nhận khi có đầy đủ các yếu tố sau: Có tuyến trùng trong sâu, sâu chết do tổ hợp tuyến trùng/vi khuẩn phải có màu vàng nhạt, gạch, nâu hoặc đen, khơng có mùi thối do vi sinh vật khác phân giải, số lượng tuyến trùng tăng do IJs đã được sinh sản trong ấu trùng.
Sau khi ấu trùng BSL chết tiến hành làm Whitetrap khoảng 7 - 10 ngày tùy từng chủng để thu ấu trùng cảm nhiễm.
2.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Giá trị sản lượng trung bình ấu trùng cảm nhiễm thu được trên mối ấu trùng BSL được xử lý theo thống kê Anon (1988b) [13].
- Trên cơ sở số liệu ấu trùng BSL chết ở các nồng độ ấu trùng cảm nhiễm gây nhiễm ban đầu khác nhau có thể tính được chỉ số LC50 theo quy trình xử lý PROBIT
(Anon, 1988a) trong phần mềm SPSS 11.0 [12].
- Các số liệu kết quả thu được của các thí nghiệm đều được xử lý thống kê theo ANOVA trong chương trình thống kê SPSS 20.0. Số lượng tuyến trùng thu được đều được chuyển sang log(x+1) trước khi cho vào xử lý.
- Sử dụng chương trình BLAST để tìm kiếm các trình tự tương đồng đã được các tác giả khác công bố trên ngân hàng ADN (GenBank).
- So sánh sự khác nhau về vị trí nucleotit giữa các cặp lồi dùng phần mềm ClustalW.103 . Phần mềm MEGA 4.0 được dùng để phân tích khoảng cách di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp Minimum Evolution (ME) .
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Sau quá trình khảo sát, thu mẫu và phân lập các chủng EPN từ các tỉnh Tây Nguyên, chúng tôi đã thu được 3 mẫu tuyến trùng thuộc giống Steinernema từ 314
mẫu đất. Như vậy, tỷ lệ hiện diện của tuyến trùng trong mẫu đất cà phê Tây Nguyên chỉ là 0,95 %. Sau khi phân lập và phân tích đặc điểm hình thái, hình thái lượng (morphometrics) và đặc trưng sinh học phân tử có thể kết luận 3 mẫu tuyến trùng thu được là cùng một loài Steinernema siamkayai Stock, Somsook & Reid, 1998. Đây là lồi tuyến trùng đã được mơ tả từ Thái Lan và lần đầu được ghi nhận ở Việt Nam nên đây là ghi nhận mới cho Việt Nam.
Ngồi các đặc điểm hình thái và số đo phù hợp với hình thái và số đo mơ tả gốc của S. siamkayai, chủng này ở Việt Nam cũng có các đặc điểm riêng, đặc biệt một số sai khác về hệ số đo, đặc thù cho tính bản địa của chúng. Ký hiệu chủng tuyến trùng thu được là S-DL13.Những đặc điểm đó thể hiện sự đa dạng của lồi sẽ được trình bày dưới đây.
3.1. Đặc điểm hình thái
Con đực : Kích thước cơ thể nhỏ hơn con cái. Cơ thể cong về phía bụng khi
xử lý nhiệt. Thế hệ 1(trung bình 1312 µm) lớn hơn thế hệ 2 (trung bình 973 µm). Vỏ cutin mịn khi quan sát dưới kính hiển vi quang học, vùng bên và phasmid khơng rõ. Đầu trịn và ngắn, liên tục với cơ thể. Đỉnh đầu có 6 nhú mơi ở vịng trong và 4 nhú đầu ở vịng ngồi nhơ lên. Hai cơ quan thụ cảm hóa học (amphids) nhỏ, nằm phía sau bên nhú mơi. Xoang miệng nơng, ngắn và rộng. Thực quản cơ, phần trước thực quản hình ống, phần giữa hơi phình rộng, phần sau thực quản dạng qủa lê và khơng có van thực quản. Vịng thần kinh bao quanh eo thắt (isthmus), ngay phía trước gốc thực quản. Lỗ bài tiết nằm ở 1/3 phía sau của phần giữa thực quản, trước vịng thần kinh. Tinh hồn dạng nhánh đơn và gấp khúc ở phần sau. Gai giao cấu cong về phía bụng, có màu vàng nâu, đầu gai có chiều dài lớn hơn chiều rộng, thân gai lồi lên, tấm bản cong và có 2 sườn bên trong. Diềm gai mỏng. Gai đệm rộng và mảnh, có chiều dài bằng ¾ gai giao cấu, dạng cánh cung. Đi hình chóp và có
mucro, con đực thế hệ 2 có mucro dài hơn con đực thế hệ 1. Hệ thống nhú sinh dục gồm 11 nhú đôi và 1 nhú đơn, trong đó có 6 nhú đơi nằm trước huyệt, gần bụng, 1 nhú đơn nằm chính mặt bụng, trước huyệt, 1 nhú đôi gần bụng, sau huyệt, 2 nhú đôi gần đuôi, 1 nhú đôi mặt bên và 1 nhú đơi mặt lưng, sau huyệt.
Hình 3.1: Ảnh chụp hiển vi của con đực Steinernema siamkayai thế hệ 1. Trong đó A: Tồn bộ cở thể; B: Vùng đầu; C: Vùng đi. Scale bar = độ Trong đó A: Tồn bộ cở thể; B: Vùng đầu; C: Vùng đi. Scale bar = độ
phóng đại dưới kính hiển vi: A (x10) B, C (x100).
Con cái : Cơ thể cong về phía bụng hình chữ C khi xử lý nhiệt. Con cái thế hệ
1có kích thước cơ thể lớn, chiều dài trung bình là 5050 µm, lớn gấp đơi con cái thế hệ 2 (trung bình 2453 µm). Vùng đầu có 6 nhú mơi và 4 nhú đầu, tạo thành vòng tròn bao quanh miệng. Cấu tạo phần thực quản, lỗ bài tiết, vòng thần kinh giống như ở con đực. Nhánh sinh dục kép, gấp khúc ở phần sau, ống dẫn trứng phát triển, tử cung nằm phía bụng, bên trong chứa đầy trứng. Vagina ngắn, thành vagina có
cấu trúc cơ. Vulva hình khe, nằm gần giữa cơ thể, có cấu trúc nắp (epiptygma) đối xứng nhau.
Con cái thế hệ 1 có vuval phát triển hơn con cái thế hệ 2 với mép vulva nhô cao so với bề mặt cơ thể. Đi hình chóp, ngắn, thẳng,chiều dài của đi ngắn hơn chiều rộng cơ thể tại hậu mơn. Tận cùng đi có 1 mucro. Con cái thế hệ 2 có phần cơ thể sau hậu mơn phình ra.
Hình 3.2: Ảnh chụp hiển vi của con cái Steinernema siamkayai. Trong đó A: Toàn bộ cở thể con cái thế hệ 1; B: Vùng đầu; C: Vùng đuôi con cái thế hệ Toàn bộ cở thể con cái thế hệ 1; B: Vùng đầu; C: Vùng đuôi con cái thế hệ
1; D: Vùng đuôi con cái thế hệ 2; E: Vulva con cái thế hệ 1; F: Vulva con cái thế hệ 2. . Scale bar = độ phóng đại dưới kính hiển vi: A (x10), B (x40),
Ấu trùng cảm nhiễm: Cơ thể thn đều về phía đầu và đi, cong về phía bụng
khi xử lý nhiệt. Cutin phân đốt với các đường vân ngang, vùng bên có 6 gờ hay 7 đường bên. Vùng mơi trịn, hầu như không tách biệt với phần thân. Vùng miệng khép kín. Thực quản dài, hẹp. Thực quản gốc phình rộng về phía sau tạo thành diều sau thực quản và nằm lệch về phía lưng. Vịng thần kinh nằm bao quanh isthmus. Lỗ bài tiết nằm ở khoảng 1/3 trước của thực quản. Ruột cùng dài, mảnh phân biệt với hậu môn. Mầm sinh dục đã xuất hiện tương đối rõ. Đi hình chóp, nửa sau đi thường vót nhọn và hơi cong về phía bụng.
Hình 3.3: Ảnh chụp hiển vi của ấu trùng cảm nhiễm Steinernema siamkayai. trong đó A: Tồn bộ cở thể; B,D: Vùng đầu; C: Vùng đuôi. . Scale bar = độ trong đó A: Tồn bộ cở thể; B,D: Vùng đầu; C: Vùng đuôi. . Scale bar = độ