NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU
Các thành phần sesquitecpenoit, thiazin, steroid, và các hợp chất phenolic có
mặt trong nhiều lồi Xanthium strumarium của nhiều nước và có chức năng sinh học nhất định trong cây thuốc này. Tuy vậy cho đến nay vẫn chưa có các nghiên cứu hệ thống cho thấy rõ sự phân bố của các thành phần này trong cây Ké đầu ngựa trồng ở Việt Nam. Với mục đích đánh giá các thành phần terpenoid, flavonoid, và steroid trong cây thuốc Ké đầu ngựa của Việt Nam Luận văn này nghiên cứu thành phần hoá học của cây Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) được thu thập ở Hịa Bình. Nhiệm vụ được đề ra cho nghiên cứu trong Luận văn bao gồm:
1. Xây dựng quy trình chiết các hợp chất hữu cơ thiên nhiên từ cành và lá cây Ké đầu ngựa Hịa Bình.
2. Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết để định tính các phần chiết và xác định các hệ dung mơi thích hợp cho phân tách sắc ký cột.
3. Phân tách sắc ký các phần chiết và phân lập các hợp chất thành phần chính bằng các phương pháp sắc ký điều chế.
4. Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập bằng các phương pháp phổ hiện đại.
5. Đánh giá sự khác biệt các thành phần terpenoid, flavonoid, và steroid của cây Ké đầu ngựa trồng ở Hịa Bình với các lồi Xanthium strumarium đã được nghiên cứu.
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu
Mẫu thực vật sau khi được thu hái được phơi khơ trong bóng râm, sấy ở nhiệt độ 40 oC và xay thành bột mịn. Bột nguyên liệu được ngâm với metanol ở nhiệt độ
phòng 4 lần mỗi lần trong 3 ngày. Sau đó dung phương pháp chiết hai pha lỏng với các hệ dung mơi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, điclometan, và etyl axetat. 2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các
hợp chất
Phân tích, phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất đã sử dụng các
phương pháp chiết, các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng (TLC), các phương pháp sắc ký điều chế như sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột loại trừ theo kích thước (SEC), sắc ký cột nhanh (FC), sắc ký cột tinh chế (Mini-C), chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE), và phương pháp kết tinh chọn lọc
2.2.2.1 Phương pháp chiết hai pha lỏng
Phương pháp chiết hai pha lỏng là dung một dung mơi thích hợp hịa tan chất cần tách khỏi pha nước chứa các chất ít tan trong pha hữu cơ. Sau khi tách lấy dịch chiết, cất loại dung môi cho các chất hữu cơ cần quan tâm.
2.2.2.2 Các phương pháp sắc ký
Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Chuẩn bị mẫu phân tích: Hịa tan mẫu thử trong dung mơi thích hợp (1
mg/ml), sau đó dùng capilla hút dịch mẫu bằng lực mao quản chuyển dung dịch mẫu lên trên lớp chất hấp phụ ở vị trí của tuyến xuất phát.
Dung môi triển khai: Các dung môi dùng trong TLC đều được làm khan và
chưng cất lại khi sử dụng. Các hệ dung môi được pha theo tỉ lệ phù hợp. Sau khi pha phải lắc kỹ cho các dung môi trong hệ trộn đều rồi cho vào bình triển khai sắc ký đáy có nút nhám kín. Để n đến khi bình được bão hịa dung môi mới tiến hành triển khai bản mỏng.
Triển khai bản mỏng: Bản mỏng được cắt kích thước phù hợp, có hai tuyến dung mơi là tuyến trên và tuyến dưới. Dùng kẹp sắt đưa nhanh bản mỏng đã được tẩm mẫu vào bình chạy sắc ký, đậy nắp kín, để yên quan sát. Khi quan sát thấy dung
môi đã chạy đến tuyến dung môi trên, dùng kẹp sắt lấy bản mỏng ra khỏi bình và tiến hành nhận biết vệt chất trên bản mỏng.
Phát hiện vệt chất trên bản mỏng:
Đèn tử ngoại: Bản mỏng được chiếu dưới bước sóng tử ngoại ở λ = 254 nm. Thuốc thử hiện màu: Bản mỏng được phun các thuốc thử 5% FeCl3/EtOH và 1% vanillin/H2SO4 đặc hay 8% (Ce)2SO4/H2SO4 (15 %) sau đó được hơ nóng ở 120
oC.
Đánh dấu vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu sắc của các vệt chất. Dựa vào sắc ký đồ TLC có thể đánh giá sơ bộ số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp, khả năng phân giải của hệ dung môi và định hướng cho phân tách sắc ký điều chế.
Sắc ký cột thường (CC)
Sắc ký cột được thực hiện trên chất hấp phụ silica gel theo cơ chế sắc ký hấp
phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất thiên nhiên.
Phân tách hỗn hợp các chất được thực hiện dựa trên sự khác biệt về tốc độ di
chuyển của các chất khi pha động đi qua pha tĩnh. Pha tĩnh thường là silica gel được nhồi trong một cột sắc ký và pha động là hệ dung môi chạy cột.
Sắc ký cột thường (CC) được thường được thực hiện dưới trọng lực của dung môi.
Sắc ký cột nhanh (FC)
Phân tách sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp suất nén. Chất hấp
phụ cho FC thường là silica gel.
Các cột sắc ký thủy tinh (Sigma-Aldrich) có đường kính khác nhau được sử
dụng tùy theo khối lượng mẫu cần phân tách. Sắc ký cột tinh chế (Mini-C)
Phân tách sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được sử dụng để tinh chế các hợp chất
hữu cơ. Cột Pasteur pippet (0,7 cm i. d. × 10 cm) được nhồi silica gel Merck (cỡ hạt 15-40 μm) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) được sử dụng cho Mini-C.
Kỹ thuật nhồi cột ướt và đưa mẫu lên cột tẩm trên silica gel hoặc đưa mẫu trực
tiếp đã được sử dụng cho các phương pháp sắc ký CC, FC và Mini-C. Sắc ký cột loại trừ theo kích thước (SEC)
Sắc ký cột loại trừ theo kích thước được thực hiện theo chế độ CC dưới trọng
lực của dung môi. Chất hấp phụ cho sắc ký là Sephadex LH-20 (cỡ hạt 25-100 µm) (Pharmacia Fine Chemicals, Thụy Điển).
Chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE)
Chiết pha rắn trên pha đảo là quá trình chuyển chất tan (chất cần phân tích) từ
pha lỏng sang pha rắn. Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu, làm giàu và làm sạch mẫu phân tích. Pha rắn là loại chất hấp phụ kỵ nước kiểu silica gel biến cải (C-18) có kích thước 40 µm với đường kính lỗ xấp xỉ 60 Ao liên kết với nhóm octodecylsilan, pha động là dung mơi phân cực thường là MeOH-H2O.
Cột RP-SPE được sử dụng là C18 Sep-Pak Vac catridge (Waters, Hoa Kỳ). Quá trình chiết pha rắn thường được tiến hành qua 3 giai đoạn.
Giai đoạn 1: Hoạt hóa pha tĩnh. Cho dung môi chảy qua cột chiết để thấm ướt các pha tĩnh, hoạt hóa các nhóm chức, đuổi bọt khí, lấp đầy dung mơi vào khoảng trống. Sau khi hoạt hóa, pha tĩnh cần được ngâm trong dung mơi.
Giai đoạn 2: Đưa mẫu phân tích vào cột chiết. Các chất phân tích bị hấp phụ thành dải ở phần đầu của cột chiết nhờ lực tương tác phân tử, hoặc liên kết hydro, lưỡng cực-lưỡng cực, hoặc theo cơ chế trao đổi ion.
Giai đoạn 3: Làm sạch mẫu phân tích. Tiến hành rửa giải cột chiết bằng dung môi để rửa giải chất phân tích và loại bỏ các tạp chất.
Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để phân lập và tinh chế chất rắn. Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của chất ở các nhiệt độ khác nhau.
2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ:
Phổ hồng ngoại (IR);
Phổ khối lượng ion hóa phun bụi electron (ESI-MS); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR);