CHƢƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.7. Tách chiết và tinh sạch enzyme ngoại bào
2.3.7.1. Cô đặc dịch nuôi cấy bằng hệ thống lọc tiếp tuyến
Chủng vi khuẩn nghiên cứu đƣợc ni cấy trên 1 lít mơi trƣờng với nhiệt độ, pH và thời gian thích hợp, sau đó ly tâm dịch ở 6.000 v/p trong 15 phút để loại bỏ tế bào. Dịch sau ly tâm đƣợc cô đặc bằng hệ thống lọc tiếp tuyến với màng lọc 300 kDa và 10 kDa để loại bỏ những hợp chất có khối lƣợng phân tử nằm ngoài 2 khoảng trên.
2.3.7.2. Tủa enzyme bằng muối ammonium sulfate
Đầu tiên, dịch có chứa enzyme bị tủa ammonium sulfate ((NH4)2SO4) ở nồng độ bão hòa 30%, sau đó hỗn hợp đƣợc ngâm trong đá 30 phút, ly tâm ở 9.500 v/p
trong 15 phút ở 4o
C.
Hút phần dịch trong sang ống nghiệm khác, tiếp tục bổ sung từ từ (NH4)2SO4
đến khi đạt nồng độ 80% (xem phụ lục C). Hỗn hợp đƣợc ủ và ly tâm nhƣ trên. Loại bỏ dịch, phần tủa đƣợc hòa tan bằng 1 ml đệm dùng chạy sắc ký trao đổi ion.
y = 0,017x + 0,004 R² = 0,998 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 0 20 40 60 80 100 M ật độ q ua ng (O D750 n m )
Nồng độ L-tyrosine (µg/ml) Hình 2.4. Đồ thị đƣờng chuẩn theo
2.3.7.3. Sắc ký trao đổi ion
Cột đƣợc cân bằng với đệm (xem phụ lục A) và điều chỉnh tốc độ dòng là 3 ml/phút trƣớc khi đƣa mẫu lên. Dùng pipet đƣa mẫu lên cột. 20 phân đoạn đầu (thể tích mỗi phân đoạn là 5 ml) rửa cột bằng đệm. 20 phân đoạn sau thôi cột bằng gradient NaCl (từ 0 đến 1 M) nhằm đẩy những enzyme bám cột trơi ra ngồi. Tiến hành định tính và định lƣợng các enzyme ngoại bào của 40 phân đoạn. Phân đoạn nào có hoạt độ enzyme cao đƣợc bảo quản để dùng trong các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.7.4. Sắc ký lọc gel
Phần dịch thu đƣợc sau khi chạy sắc ký trao đổi ion tiếp tục đƣợc tủa bằng muối ammonium sulfate. Hòa tan tủa trong 1 ml đệm phosphate 50 mM pH 7 có bổ sung NaCl nồng độ 0,15 M dùng để chạy sắc ký lọc gel với cột Hiload 16/60, thể tích cột là 120 ml. Điều chỉnh tốc độ dòng chảy của cột sắc ký lọc gel là 1 ml/phút, dùng pipet đƣa dịch chứa enzyme lên cột, thu 40 phân đoạn (thể tích mỗi phân đoạn là 3 ml). Tiến hành định tính và định lƣợng nhanh các enzyme ngồi bào ở 40 phân đoạn. Cuối cùng, để xác định trọng lƣợng phân tử cũng nhƣ đánh giá mức độ tinh sạch của enzyme, chúng tôi tiến hành chạy điện di protein trên gel polyacrylamide SDS-PAGE.
2.3.7.5. Điện di SDS-PAGE
Mức độ tinh sạch và trọng lƣợng phân tử của enzyme đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) của Laemmli (1970). Thành phần bản gel xem phụ lục A.
Sau khi đổ lớp resolving gel ta bổ sung ngay một lớp nƣớc lên trên và chờ 30 phút để gel đơng. Sau đó loại bỏ lớp nƣớc và đổ tiếp lớp stacking gel lên trên, gắn lƣợc và chờ tiếp 30 phút nữa. Đặt bản gel vào buồng điện di và nạp mẫu.
Mẫu enzyme đƣợc trộn đều với SDS reducing buffer (xem phụ lục A) với tỷ
lệ thể tích là 1:4. Xử lý mẫu ở 94oC trong 4 phút sau đó tra mẫu vào giếng và để ổn
định trong 5 phút trƣớc khi chạy. Chạy điện di với hiệu điện thế là 110 V trong 1 giờ 45 phút.
Sau khi chạy điện di xong, tiến hành nhuộm bản gel SDS-PAGE nhƣ sau: nhuộm gel trong bể nhuộm với 100 ml dung dịch Coomassie Brilliant Blue R-250 trong 30 phút. Sau đó, bản gel đƣợc ngâm 1 giờ trong dung dịch Destain (xem phụ
lục A) rồi đƣợc rửa bằng nƣớc. Quan sát các băng, so sánh với thang chuẩn